Cualquier proyecto de ciencias de la vida que requiera la investigación de ultraestructura 3D de una región específica de interés en una muestra biológica compleja puede hacer uso de esta técnica. El procedimiento de preparación de la muestra es el mismo para dos modalidades de diagnóstico por imágenes que son SBF/SEM y FIB-SEM. El uso del microondas acelera sustancialmente la parte de procesamiento de la muestra.
Aunque se muestra aquí para las puntas de raíz, este protocolo se puede utilizar para cualquier sistema de modelos biológicos con ajustes mínimos. Antes de utilizar este flujo de trabajo para correlacionar SBF/SEM y FIB-SEM, uno debe estar familiarizado con las tecnologías individuales. La ejecución de ciertos pasos se demuestra fácilmente pero es difícil de describir en texto escrito.
Demostrar el procedimiento será Peter Borghgraef quien sea técnico en nuestro laboratorio. Para empezar, corte las puntas de las raíces de las plántulas fijas de Arabidopsis thaliana en las placas de agar y coloque de dos a tres puntas en tubos de Eppendorf que contengan el mismo fijador durante la noche a cuatro grados centígrados. Por la mañana, con una pipeta, sustituya el fijador por 0,1 tampón de fosfato molar a pH 6,8 en los tubos por los tubos de una mesa giratoria a 100 RPM y lave durante 10 minutos.
A continuación, repita el lavado con tampón de fosfato fresco cinco veces. En una campana de humo, después de fijar las puntas de raíz reemplazando el tampón de fosfato con 2%tetróxido de osmio y 0.2%ruthenio rojo en 0.1 tampón de fosfato molar a pH 6.8 con los tubos con tapas abiertas en un microondas e iniciar el programa. A continuación, deseche la solución en los tubos y lave las puntas de las raíces dos veces con agua destilada doble durante cinco minutos cada una.
Para el tercer y cuarto lavado de agua destilada doble, utilice el microondas para ayudar al lavado. Después del primer lavado de agua destilada doble de 40 segundos, saque las muestras de punta de raíz del microondas y reemplace el agua destilada doble con agua destilada doble. Vuelva a colocar las muestras en el microondas y continúe con el programa.
A continuación, prepare la solución TCH añadiendo 0,1 gramos de tiocarbohidruida a 10 mililitros de agua doble destilada en un tubo de 15 mililitros. Coloque el tubo en un horno y caliente a 60 grados Centígrados durante una hora para disolver. A continuación, filtre la solución TCH con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.
Sustituya inmediatamente la solución en los tubos de muestra por la solución TCH filtrada y continúe con el protocolo. Ahora sumerja las muestras en etanol y colóquelas en el microondas para deshidratarlas en pasos calificados de 50%70%90% y luego dos veces de 100% tratamiento de etanol. Después del tratamiento de deshidratación de óxido de propileno, añadir 50%Resina de Spurr en los tubos para iniciar la infiltración de las puntas de la raíz durante un mínimo de dos horas.
Después de la incubación final en resina 100%Spurr, coloque las puntas de raíz en la incrustación de moldes y llene los moldes con resina fresca de 100%Spurr y polimerizar en un horno a 65 grados Celsius durante 36 a 48 horas. En primer lugar, utilice una cuchilla de afeitar para recortar aproximadamente la muestra polimerizada en un bloque delgado. Con el lado que tiene tejido expuesto hacia abajo, une la muestra al centro de un pasador de metal con resina epoxi conductora para que el tejido toque el pasador de metal.
Coloque la muestra en un horno a 65 grados centígrados para curar el epoxi durante la noche. Por la mañana, cargue el pasador de metal en el portaequipajes y utilice una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier exceso de epoxi de la muestra. Para suavizar aún más la cara de la muestra, cargue el soporte con el pasador metálico en el soporte para el ultramicrotome.
En el ultramicrotoma, utilice un cuchillo de vidrio o diamante para suavizar la cara de los lados del bloque formando una pirámide. Asegúrese de que al menos parte del tejido ya esté expuesto en la cara del bloque. A continuación, coloque el bloque de muestra recortado en el revestimiento de pulverización y ajuste los ajustes a platino en dos a cinco nanómetros para recubrir la muestra con una capa delgada.
Inserte el portador en el microscopio SBF-SEM. Lleve el cuchillo de diamante cerca de la superficie de la muestra y recorte la parte superior de la muestra para eliminar la capa de platino y exponer parte del tejido. A continuación, ajuste la tensión de aceleración a 1,5 a 2 kilovoltas.
Capturar una imagen del tejido y configurar una carrera de imágenes. Con el software Fiji, seleccione el archivo, la importación, la secuencia de imágenes y localice la pila de imágenes para cargar las imágenes. Después de ajustar la imagen según el manuscrito, compruebe la alineación desplazándose por el conjunto de datos.
Utilice el comando guardar en el menú de archivos para guardar el conjunto de datos alineado como un archivo TIFF 3D. Analice cuidadosamente el conjunto de datos para ver si se incluye el ROI y contiene la información necesaria para la pregunta biológica. En la última imagen de la pila, que es la cara de bloque actual en el microscopio SBF-SEM, seleccione un nuevo ROI para FIB-SEM.
Después de revescar con platino de nuevo, cargue la muestra en el FIB-SEM y utilice el detector de electrones secundario a 15 kilovoltas y un nanoamplificador para localizar el ROI identificado en el SBF-SEM en la cara del bloque. Mueva e incline el escenario para llevar el ROI de la muestra al punto de coincidencia de las vigas FIB y SEM, utilizando el sistema de inyección de gas y haz FIB. Deposite una capa protectora de un micrómetro de platino en la superficie por encima del ROI.
A continuación, utilizando una baja corriente de fresado que oscila entre 50 y 100 picoamps, fresa líneas finas en la deposición de platino para el enfoque automático y el seguimiento 3D durante la ejecución de imágenes. A continuación, utilizando una alta corriente de fresado de 30 nanoamplificadores, fresar una zanja de 30 micrómetros delante del ROI creando la superficie de imagen para el haz SEM. Después de suavizar la superficie de la imagen, inicie la ejecución de imágenes y supervise la estabilidad del proceso durante las primeras 50 a 100 secciones.
Una vez que el sistema funciona sin problemas, salga de la habitación y asegúrese de que haya la menor perturbación posible en la habitación. Las imágenes del SBF-SEM proporcionan una visión general del tejido que da una visión de la orientación espacial de las células y las conexiones intracelulares. La siguiente imagen FIB-SEM en una nueva región añade detalles de alta resolución de células y estructuras específicas.
Los datos SBF-SEM muestran una representación diferente de los vóxeles no isotrópicos a partir de los datos VOB-SEM voxel isotrótrópicos. SBF-SEM presenta un efecto de escalera en la superficie, mientras que los datos FIB-SEM que tienen las cinco secciones de nanómetro aseguran que el renderizado parezca mucho más suave y las secciones individuales se mezclan completamente en la superficie. Este protocolo describe la creación de imágenes de una región única en una sola muestra y cualquier desviación del flujo de trabajo puede causar daños a la muestra, lo que hace imposible reubicar la región de interés.
