Este protocolo permite la reconstrucción 3D de orgánulos de forma sencilla y robusta, a la vez que es accesible a laboratorios que actualmente no cuentan con microscopios electrónicos de volumen especializados. Esta técnica es extremadamente flexible, proporcionando una excelente resolución X / Y, al tiempo que puede volver a obtener muestras si es necesario. También es compatible con la tomografía basculante cuando se requiere una resolución Z muy alta.
Esta técnica permite interrogar la morfología de los orgánulos en contextos interorgánulos. Por lo tanto, se puede extender para examinar cualquier condición patológica con defectos de orgánulos. Este enfoque puede proporcionar información sobre las interacciones de orgánulos y los eventos de tráfico celular.
Este método también se puede aplicar a otros tejidos, modelos de organoides y sistemas de cultivo celular, además de los hepatocitos. Los usuarios primerizos pueden encontrar que la seccionamiento en serie y la recogida son un desafío sin pérdida. Se recomienda ser competente en la sección ultradelgada regular antes de aplicar este protocolo a una muestra preciosa.
Comience recortando cuidadosamente el tejido incrustado en resina con una cuchilla de afeitar con la muestra bloqueada en el adaptador de recorte. Transfiera el arca del espécimen junto con el mandril y la muestra al brazo del espécimen del microtomo y coloque el arca del espécimen de modo que el rango de viaje del arca se extienda de arriba a abajo. Coloque y bloquee el cuchillo de diamante en el soporte del cuchillo, asegurándose de que el ángulo de corte del cuchillo esté ajustado adecuadamente.
Bloquee el soporte del cuchillo en el escenario de forma segura. Apague la iluminación descendente del escenario, encienda la iluminación ascendente del escenario, mueva con precaución el cuchillo hacia la muestra, ajustando continuamente el ángulo lateral del cuchillo, la inclinación de la muestra y la rotación de la muestra ajustando las perillas relevantes hasta que la cara del bloque esté alineada con el filo del cuchillo. Coloque la parte superior e inferior de la ventana de corte del brazo de la muestra y deje la muestra justo debajo del filo del cuchillo.
Llene el bote del cuchillo con agua limpia y doble destilada y asegúrese de que la superficie del agua esté nivelada con el filo del cuchillo y ligeramente cóncava. Luego, comience a cortar secciones. Detenga el corte justo después de que la muestra haya pasado el filo del cuchillo.
Utilice una cuadrícula de ranura vacía para estimar el número de secciones que se van a recopilar en cada cuadrícula. Usando una pestaña en cada mano, rompa suavemente la cinta en cintas más pequeñas que puedan caber en la longitud de la rejilla de la ranura. Haga una nota mental de sus posiciones relativas dentro de la muestra.
Usando una varilla aplicadora de vidrio, coloque una gota de cloroformo sobre las secciones para aplanarlas. Tome la primera rejilla de ranura vacía con las primeras pinzas numeradas y sumérjala suavemente en el Tritón X-100 y luego dos veces en el agua destilada. Use un trozo de papel de filtro para eliminar el exceso de agua del borde de las pinzas.
Usando fórceps, baje suavemente aproximadamente 2/3 de la rejilla de ranura recubierta de formvar en el agua del bote de cuchillos. Asegúrese de que el lado formvar esté hacia abajo y que el borde largo de la mano derecha de la ranura esté en la superficie del agua y paralelo al borde del agua. Mueva suavemente la rejilla en el agua hacia las cintas para que en el golpe de retorno, las secciones se desvíen hacia la rejilla.
Continúe haciendo esto en ondulaciones cada vez más pequeñas, hasta que el borde derecho de la cinta se alinee con el borde derecho de la ranura. Luego, con el último waft, suba suavemente la rejilla para recoger las secciones en la rejilla de la ranura. Coloque varios gránulos de hidróxido de sodio debajo de la tapa de una placa de Petri para proporcionar un ambiente libre de dióxido de carbono.
Luego, pipetee cuidadosamente gotas de 40 microlitros del citrato de plomo de Reynold en la parapelícula, una gota por cada rejilla. Invierta cada rejilla en la gota de citrato de plomo y déjela protegida por la tapa de la placa de Petri durante 7 a 10 minutos. Mientras las rejillas se tiñen, coloque cinco gotas de agua destilada de aproximadamente 300 microlitros para cada rejilla en la parapelícula.
Al final de la incubación del citrato de plomo, transfiera cada rejilla a una gota de agua destilada para lavar durante un minuto sin respirar directamente en las rejillas. Repita esto cuatro veces más. Use pinzas cruzadas numeradas para recoger la primera rejilla.
Toque el borde de la rejilla para filtrar el papel para absorber la mayor parte del agua y dejar secar en las pinzas durante al menos 20 minutos. Repita esto para cada cuadrícula. Con un aumento bajo, observe el orden, la ubicación y la posición de las secciones en serie.
Desplácese hasta la sección central de la serie en la cuadrícula. Examine la muestra e identifique una región de interés. Luego, observe la muestra en el aumento deseado.
Considere la posibilidad de recopilar la serie con un aumento ligeramente menor, ya que las secciones a menudo no están perfectamente alineadas y es posible que las imágenes deban recortarse más tarde. A continuación, tome imágenes de referencia con aumentos más bajos. Esto ayudará a apreciar el contexto de la región de interés, su ubicación aproximada a diferentes aumentos en relación con los límites de la sección y las características de referencia dentro de la muestra.
Utilícelos para indicar la región de interés en otras secciones. Para hacer referencia a la pantalla, use masilla adhesiva reutilizable, pegatinas o un trozo de papel de retroproyector pegado a la pantalla para colocar marcadores temporales en la pantalla. Esto permitirá la reimaginación rutinaria de las mismas características de la región de interés en el centro de la imagen en todo el conjunto de datos.
Abra la pila de imágenes, especifique las medidas del vóxel y seleccione la pestaña Segmentación para iniciar la segmentación. Haga clic en Nuevo en el panel del editor de segmentación para definir nuevos objetos en la lista de materiales. Haga clic con el botón derecho para cambiar el color del objeto y haga doble clic para cambiar el nombre del objeto.
Para la segmentación manual, elija la herramienta de segmentación debajo de la lista de materiales y seleccione la herramienta de pincel predeterminada para resaltar los píxeles. La imagen de microscopía electrónica de dos hepatocitos opuestos se muestra aquí. La imagen de mayor aumento permite la observación de los detalles morfológicos de los diferentes orgánulos con resolución nanométrica.
La imagen representativa muestra la versión segmentada del mismo tomograma, el rastro del retículo endoplásmico, las mitocondrias y los contactos intermembrana entre la sala de emergencias y las mitocondrias de diferentes espacios se muestran aquí. La imagen representativa muestra un ortocorte inclinado superpuesto con trazas de segmentación y su posición relativa dentro de toda la mitocondria. Aquí se muestra la reconstrucción 3D de los orgánulos segmentados y los contactos endoplásmicos retículo-mitocondria en diferentes ángulos.
Como este protocolo es compatible con la tomografía basculante cuando se necesita una resolución Z muy alta, ayuda a resolver estructuras pequeñas o enrevesadas. Esta técnica es perfecta para la evaluación inicial de la relación espacial entre diferentes orgánulos y, por lo tanto, particularmente útil en el campo progresivo de los contactos de membrana en la homeostasis de membrana.
