1. Ejemplo de fijación e inclusión de resina <ol><li> Las muestras de tejido fresco y las células se fijan por lo menos 2 horas en 2% de paraformaldehído y glutaraldehído al 2,5% en tampón fosfato 0,1 M a un pH de 7,4. El tamaño de la muestra no debe exceder de 0,150 mm de espesor para permitir la penetración adecuada o fijador, y no debe ser dejado en la solución para más de 12 horas. </li><li> Colocar las muestras en viales de cristal de centelleo de 20 ml y enjuagar tres veces, 5 minutos cada uno, en 0,1 M tampón cacodilato. </li><li> Mancha con un 1,5% (w / v) de tetróxido de osmio ferrocianuro de potasio y el 1% (w / v) en tampón cacodilato 0,1 M (0,1 M, pH 7,4) durante 30 minutos. </li><li> Tinción con tetróxido de osmio al 1,0% (w / v) en tampón cacodilato 0,1 M durante 30 minutos. </li><li> Enjuague inmediatamente con agua destilada durante 3 minutos. </li><li> Mancha con un 1% (w / v) de acetato de uranilo en agua destilada durante 30 minutos. </li><li> Enjuague las secciones de 5 minutos en agua destilada, y luego deshidratar alcohol en serie gradual, a 2 minutos de cada cambio (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Insertar en el aumento de las concentraciones de resina Durcupan mezclada con etanol, a 30 minutos de cada cambio, a partir de 50% Durcupan en etanol, a continuación, seguido de: 70%, 90%, 95%, y luego el 100%. </li><li> Reemplazar con Durcupan fresco y agitar lentamente durante 4 horas. </li><li> Secciones lugar, usando palos de madera de cóctel, en los microscopios portaobjetos de vidrio recubierto con un agente de separación del molde, y colocar en horno de 65 ° C durante 24 horas. </li></ol> 2. Preparación de la muestra para el FIB / SEM <ol start="11"><li> Separar la capa de resina, que contienen las muestras, de entre los dos portaobjetos de vidrio y lavar a fondo para eliminar cualquier agente de separación del molde. </li><li> Utilizando un microscopio de luz transmitida con los objetivos de baja potencia, o microscopio de disección con iluminación transmitida, para identificar la región de interés en el trozo de resina. </li><li> Corte un pequeño (3 mm x 3 mm) cuadrado alrededor de la región de interés, utilizando una hoja de afeitar y el palo esta en la parte superior del bloque de resina blanco con adhesivo acrílico (Figura 1). Espere 5 minutos para que el pegamento se endurece, y luego proceder con el siguiente paso. </li><li> Sujete el bloque en el titular de la ulramicrotome y, usando el microscopio estereoscópico adjunta, recorte alrededor de la región de interés con una cuchilla de afeitar hasta que sólo una pequeña pirámide de los restos materiales. </li><li> Más acabado del bloque, con un cuchillo de cristal fijo en el ultramicrotomo, de modo que la región de interés puede ser localizado con precisión en relación con las dimensiones de la superficie del bloque (Figura 1). Cortar un extremo de la cuadra, cerca de la región de interés, de modo que un paso perpendicular se corta a través de la muestra (Figura 1 y 2). Este paso forma la cara de imagen (Figura 2). </li><li> Retire el bloque de la ultramicrotomo y fotografiar la región de interés dentro del bloque, utilizando un microscopio de luz transmitida. </li><li> Cortar la manzana recortada desde el talón de resina restante. Esto se hace mediante el uso de sierra de joyero y asegura que sólo un pequeño bloque se coloca dentro de la FIB / SEM. La altura total de este bloque no debe ser superior a 5 mm. </li><li> Pegue el bloque a un trozo de aluminio con pasta de carbono asegurar que la cara de imágenes se encuentra en el borde exterior (Figura 1). </li><li> Después de que el pegamento se haya secado, cubra el bloque con una fina capa de oro (&gt; 20 nm; vacío Cressington sistema de evaporación). </li></ol> 3. Imagen en el FIB / SEM <ol start="20"><li> Con un aumento bajo, y el uso de imágenes de electrones secundarios (5 kV, 0,5 NAMP), oriente el bloque para que la zona elegida de interés y el lado de la manzana para obtener imágenes que se enfrenta el operador (Figura 2 c, d). </li><li> Orientar el bloque de manera que la cara que se encuentra reflejado en paralelo a la viga de la molienda. Esto significa que un haz de electrones se orienta a 54 ° de esta cara (Figura 2 b). </li><li> El uso de un haz de iones actual de 13 a 27 NAMPS a 30 kV eliminar una banda estrecha de la resina de la parte frontal de la región a explorar. </li><li> Cambiar al modo de imágenes de retrodispersión para ver la cara molida que cubre la región de interés. </li><li> Utilizando la imagen de microscopía de luz de referencia (tomada en el paso 16) y la imagen de la cara molida localizar la región exacta en el bloque de fresado y la imagen (Figura 2). </li><li> Depositar una capa de protección (aproximadamente 1 micra de espesor) de carbono (o metal), mediante el sistema de inyección de gas del microscopio, en la superficie del bloque, por encima de la región de interés (Figura 2). </li><li> Utilizando una corriente de 700 picoamperios, el molino fino de la región del bloque en el que las imágenes finales que se adopten. </li><li> Deja el haz de molienda por completo fábrica de esta cara de la imagen hasta que no haya artefactos de molienda se puede ver en la cara. Una planta completa de la cara está marcada por la observación de cambios en cada imagen posterior en todo el campo de visión. Molienda inadecuada también puede verse como rayas blancas o &quot;cortinas&quot; que aparecen vertically en la imagen. </li><li> Dejar el microscopio por lo menos de 2 horas para que los cambios térmicos a disiparse. Esto reduce el riesgo de que la cara del bloque a la deriva durante la exploración, lo que resulta en imágenes desalineadas. </li><li> Seleccionar los parámetros de microscopio para obtener imágenes de la cara de serie. Asegúrese de que el haz de electrones tiene una tensión que es lo suficientemente bajo como para la imagen sólo muy poca profundidad de material en la cara del bloque. Esto también debería ser mucho menos profundo que el espesor de la cara para ser eliminado. Los parámetros típicos de imágenes son los voltajes de entre 1,2 a 2,0 kV con un tamaño de pixel de entre 4 a 20 nm. El píxel habitan necesita tiempo para mantenerse en torno al 10 μsecs para que el tiempo total para la cara y el molino de adquirir una imagen se mantiene por debajo de 2 minutos (Figura 3). </li></ol> 4. Secretos para el éxito Paso 1) Asegúrese de que las muestras no son más gruesas de 150 micrones. Esto permitirá una adecuada penetración de las manchas de diferentes y de la resina en el material. Esto se puede lograr por la sección de la muestra con un vibratome inmediatamente después de la fijación. Este espesor es apropiada para el tejido cerebral. Otros tejidos deben ser probados para asegurar una adecuada fijación y tinción. Paso 3) Las muestras deberán ser distribuido libremente a través de la solución, y no agrupadas en una parte del vial, mientras que el fijador de secundaria se introduce. Esto asegurará la máxima penetración de la muestra y reducir la muestra se distorsione durante este proceso de fijación. Esto se logra girando suavemente las muestras en el frasco inmediatamente después de la disolución se añade. Paso 15) Asegúrese de que la región de interés se encuentra inmediatamente por debajo (&lt;30 micras) de la superficie del bloque. Esto reducirá la cantidad de molienda por el haz de iones en la fase de adquisición de imágenes. Paso 22) El tiempo de escaneo del haz de iones debe ser adequte para asegurarse de que la cara de imágenes todo es completamente molido. Molienda inadecuada se muestra como manchas blancas, o de &quot;cortinas&quot; que aparece verticalmente en la cara de imagen. Paso 26) La cara final molida debe ser mayor que la cara que se va a examinar. Esto se debe a la resina molida es expulsada del bloque y redepósitos en la superficie del bloque en las inmediaciones. Este redeposición puede invadir en el campo de la imagen de vista, y se evita el fresado de una zona mucho más grande que se forma la imagen. Para una ventana de imagen que es de 20 micrones de ancho, la cara del bloque molido es mayor de 30 micrones de ancho. Paso 29) Es fundamental que los parámetros del haz de electrones son tales que la imagen es generada por electrones que se desprenden únicamente de los primeros nanómetros de la superficie del bloque. Este es un acheved reduciendo al mínimo la tensión por debajo de 2 kV y asegurar que no hay electrones penetran demasiado lejos. Esto también es ayudado por el uso de una tensión de red en el detector de manera que sólo los electrones con las más altas energías contribuyen a la imagen final. Por lo general, una tensión de 1,3 kV red se utiliza para una tensión de imagen de 1,5 kV. 5. Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Preparación del bloque de resina. Una resina) incrustado sección coronal (80 micras de espesor) a través de un cerebro de rata adulta se ve en un steromicroscope. La imagen muestra claramente las regiones cerebrales diferentes que pueden ser cortadas de la sección (b) utilizando una hoja de bisturí. En este caso, un cuadrado de 1 mm de la corteza se extrae y (c) pegado a un bloque de resina en blanco. D) El bloque de resina se recorta con un cuchillo de vidrio montada en un ultramicrótomo, y una vez que el bloque se ha reducido para dejar sólo la región de interés (e), un paso se corta perpendicularmente a la superficie frontal del material incluido. f) Toda esta región recortada se corta del resto de la resina y montado sobre un trozo de aluminio listo para el recubrimiento de metal y de imagen en el microscopio electrónico de barrido. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Preparación de la cara del bloque de la FIB / SEM de imágenes. A) yb) muestran ilustraciones del bloque y el borde que se muele para crear la imagen de la cara (se indica con el color negro con dos puntas de flecha). La posición del haz de iones (blanco) se muestra paralela a la cara de imágenes, y el haz de electrones (gris) se muestra golpear la cara a 54 ° para el haz de iones. C) muestra una vista del bloque tomadas con el haz de electrones y la imagen con los electrones secundarios. A lo largo de este lado del bloque de una región más oscura (indicado con caja blanca punteada) muestra una parte de la cara que ha sido más o menos elaborado (se muestra con doble cabezaed negro flecha) para revelar la muestra de base. d) Cuando esta región se crea una imagen usando sólo los electrones retrodispersados ​​el tejido embebido puede ser visto. Aquí, todo el ancho de la sección de tejido embebido se indica con una flecha doble cabeza blanca. Barra de escala en c) es de 100 micras. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Imágenes del volumen de tejido cerebral con vóxeles isotrópicos. A) invertido de contraste de imagen de retrodispersión de la cara de bloques que muestra la ultraestructura de una región del cerebro de rata. Todas las membranas son visibles, así como grandes estructuras macromoleculares. B) Un total de 1.600 imágenes se recogieron a intervalos de 5 nm resultando en una pila de imágenes con vóxeles isotrópicos. C) Esta pila se pueden obtener imágenes en cualquier plano con la misma resolución. Esta imagen muestra única conexión sináptica que es imaginada en el plano xy y el plano yz.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

La técnica de la FIB / SEM funciona de manera óptima cuando la región de interés no es demasiado grande. El límite superior de un volumen de imágenes depende del haz de iones y el área que puede consistentemente molino en repetidas ocasiones durante muchas horas. Hasta ahora esto se ha hecho con las zonas de alrededor de 60 x 60 micrones, sin embargo, imágenes de toda esta zona no es posible con una resolución de imagen adecuada, debido principalmente a que el factor tiempo en la recogida de una imagen tan grande. A modo de ejemplo, una imagen de 4 kx 4 k con un píxel de tiempo de permanencia de 10 microsegundos tomaría 2 minutos y 40 segundos para adquirir, y por un campo de visión de 60 micras esto sólo daría un tamaño de pixel de 15 nm. Para obtener imágenes de la ultraestructura de células y tejidos, un tamaño de píxel más pequeño es más adecuado, por lo general entre 4 y 10 nm / pixel. Para una superficie de 60 x 60 micrones de la imagen se adquirió en 10 horas, aunque el microscopio tenido esta capacidad. Por estas razones, el microscopio es una herramienta ideal para los volúmenes de imágenes en el orden de 10 x 10 x 10 micrones, o regiones importantes de células enteras. Esto se puede hacer fácilmente dentro de un período de 48 horas en las muestras que están bien contrastados con este procedimiento. Hasta ahora, el protocolo se ha utilizado principalmente con el tejido cerebral, así como varios tipos de células de mamífero cultivadas adherirse a cubreobjetos. Sin embargo, el procedimiento de fijación y la tinción se puede utilizar con muchos otros tipos de material biológico, incluido el material vegetal para producir igual de bien contrastada montones de imágenes. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es su capacidad para volúmenes de imágenes con vóxeles isotrópicos. Las pilas de la imagen de este tipo permiten análisis del volumen en 3D usando imágenes tomadas en cualquier plano de la pila. La ventaja de esto es permitir que el observador a las características de la imagen en la serie de imágenes desde cualquier dirección y proporcionar un mayor detalles de la imagen (Figura 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Pegamento de cianoacrilato </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Alemania </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan resina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suiza </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscopio (Zeiss, Nvision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histología diapositivas de vidrio </td><td> Menzel-Gläser, Alemania </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Fabricante de vidrio cuchillo: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Alemania </td><td></td></tr><tr><td> Viales de centelleo de vidrio (20 ml) </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehído </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Joyero vio </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Agente de separación del molde </td><td> Glorex, Suiza </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Tetróxido de osmio </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sales de fosfato de tampón fosfato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suiza </td><td> 71642 y 71496 </td></tr><tr><td> Cacodilato de sodio </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suiza </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater con el objetivo de oro </td><td> Cressington, EE.UU. </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suiza </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotomo: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Alemania </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de uranilo </td><td> EMS, EE.UU. </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Este protocolo describe cómo las muestras biológicas, como el tejido cerebral, se pueden obtener imágenes en tres dimensiones utilizando el ion del haz enfocado / microscopio electrónico de barrido (FIB / SEM). Las muestras se fijarán con aldehídos, teñido de metales pesados ​​usando tetróxido de osmio y el acetato de uranilo. Luego se deshidrata con alcohol y se infiltró con resina, que luego se endureció. Utilizando un microscopio de luz y ultramicrotomo con cuchillas de vidrio, un pequeño bloque que contiene la región de interés cerca de la superficie se hace. El bloque se coloca dentro de la FIB / SEM, y el haz de iones utilizado para aproximadamente un molino vertical de la cara en un lado de la cuadra, cerca de esta región. Utilizando electrones retrodispersados ​​a la imagen de las estructuras subyacentes, una cara más pequeña se muele con un fino haz de iones y la superficie de analizarse con más detenimiento para determinar el área exacta de la cara para ser fotografiada y se muele. Los parámetros del microscopio se ajustarán de manera que la cara es repetidamente molida y la imagen para que las imágenes de serie se recogen a través de un volumen del bloque. La pila de imágenes típicamente contienen vóxeles isotrópicos con dimensiones tan pequeñas un 4 nm en cada dirección. Esta calidad de imagen en cualquier plano de la imagen permite al usuario analizar ultraestructura celular en cualquier ángulo de visión dentro de la pila de la imagen.

Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Este protocolo describe cómo resina incrustada tejido cerebral puede ser preparado y fotografiado en las tres dimensiones en el haz de iones enfocado, microscopio electrónico de barrido.

Haz de iones enfocado fresado y microscopía electrónica de barrido en el tejido cerebral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K vistas.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Este protocolo describe cómo resina incrustada tejido cerebral puede ser preparado y fotografiado en las tres dimensiones en el haz de iones enfocado, microscopio electrónico de barrido.

Video: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Los microelectrodos de dos cañones y concéntricos para la medición de extracelular Ion señales en el tejido cerebral

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

La caracterización de propiedades mecánicas Multiescala de tejido cerebral mediante microscopía de fuerza atómica, Impacto sangría, y Rheometría

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Análisis del Cerebro Las mitocondrias Usando serie Bloque-Cara Microscopía Electrónica de Barrido

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Fabricación, pruebas y uso de microelectrodos selectivos de Ion potasio en rebanadas del tejido del cerebro adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Rebanadas hipocampales horizontales del cerebro del ratón

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...