Nuestro protocolo permite el estudio de la periodontitis periapical en un modelo de ratón accesible y controlado. Por lo tanto, este protocolo tiene ventajas sobre las muestras de pacientes o modelos in vitro. Las principales ventajas de esta técnica son que el ratón ha sido bien estudiado y que el método es técnicamente simple en términos de requisitos de la instalación y es rentable.
Como este procedimiento es difícil debido a las pequeñas dimensiones de los dientes, es beneficioso visualizar el procedimiento para aprender sobre el posicionamiento y el rendimiento de la técnica. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque el ratón en el lado dominante de la mano en una superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada y asegure las patas con cinta adhesiva. Usando una sola banda de goma por par de incisivos, y agujas largas ancladas a la superficie de espuma de poliestireno extruido de celda cerrada, apuntalar la boca abierta.
Utilice fórceps cerrados pegados a la espuma para retraer la mejilla derecha. Y coloque la espuma y el ratón bajo un microscopio y una fuente de luz. Luego, retraiga la lengua usando una espátula dental y use una aguja de calibre 27 para inyectar 25 a 50 microlitros de anestesia local en el pliegue mucobcal adyacente al primer molar mandibular.
Se debe observar hinchazón del tejido alrededor del lugar de la inyección. Para exponer la pulpa, utilice cualquier motor dental adecuado equipado con un diamante redondo de alta velocidad de 0,8 milímetros de bur dental a una velocidad de 800 rondas por minuto, para perforar la parte oclusal del primer molar mandibular derecho hasta que los cuernos de pulpa sean visibles a través de la dentina. Utilice un archivo K o H, el número ocho o el número 10 para perforar la pulpa y romper la dentina que cubre los cuernos de pulpa mesial y distal para permitir la inserción del archivo en los cuernos.
Continúe trabajando con los archivos dentro de la pulpa tan profundamente como sea posible mientras se ensancha las aberturas con los archivos, el sangrado de la pulpa se observa típicamente alrededor de los bordes afilados del diente con la fresa y eliminar el diente de la aclusión para reducir el dolor durante el experimento. Use un micro cepillo para limpiar los restos. Y dejar el primer molar mandibular izquierdo contralateral como control.
Durante los primeros tres días después del procedimiento, pesa los animales e inyecta 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina por vía intraperitoneal una vez al día. Continúe monitoreando a los animales durante los próximos 42 días pesando y evaluando el comportamiento general de dos a tres veces por semana. Y entregar pellets de alimentos suavizados con agua en un plato de Petri en el suelo de la jaula durante el período de seguimiento.
Al final del experimento, utilice tijeras quirúrgicas y fórceps para recoger la parte de la mandíbula que incluye los tres molares en ambos lados tratados y no tratados. Y usar fórceps para pelar la mayor cantidad posible de tejido blando, dejando principalmente hueso y dientes en las muestras. Enjuague brevemente el tejido en PBS.
Antes de fijar en paraformaldehído al cuatro por ciento durante 24 a 48 horas. A continuación, enjuague las muestras tres veces en PBS fresco. Para la tomografía microcalculcular, o análisis de Micro-CT, coloque los tejidos cosechados en un tubo de 12 milímetros de diámetro que contenga 1,5 mililitros de PBS en la etapa del escáner.
Con las muestras orientadas de modo que las superficies bucales o linguales del diente y la raíz se encuentran paralelas a la parte inferior del tubo. Use una esponja para separar las muestras. Y cubra la parte superior del tubo con película flexible.
Seleccione el archivo de control y establezca la energía en 70 kilovoltas, la intensidad a 114 micro amperios y la resolución en un tamaño Voxel de seis micrómetros en cubos. Haga clic en Scout-View. Cuando aparezca la imagen, haga clic en Línea de referencia y marque el área de los ejemplos para escanearlas, haciendo clic en Agregar análisis después de cada muestra.
Cuando se hayan marcado todos los ejemplos, vaya a la lista de tareas y seleccione Iniciar tareas de interacción. Para el contorno de las rodajas de Micro-CT, seleccione la rebanada que representa el centro aproximado del diente, en el que la pulpa coronal, la pulpa radicular de ambos canales y ambos foramens apicales están presentes. Haga clic en el panel de contorno y, a partir del punto distal del ápice de la raíz distal, marque el borde apical coronalmente al área apical de la clave radial, a través del borde mesial del ápice raíz de mesial, siguiendo el borde distal de la raíz mesial, y el borde mesial de la raíz distal, a través de la región de furcación.
Copie y pegue el contorno resultante y ajuste el contorno en consecuencia a cinco sectores colocados a cada lado del sector medio. Para calcular el volumen de tejido del contorno marcado para cada muestra, en Evaluación de Micro-CT, seleccione Tarea y haga clic en Evaluación 3D. A continuación, en la ventana de Evaluación 3D, haga clic en Seleccionar y seleccione un filtro para calcular el volumen de tejido.
Al final del análisis de Micro-CT, transfiera los tejidos del escáner a un tubo de micro centrífuga que contenga un mililitro de EDTA durante 10 días. Al final de la descalcificación, coloque las muestras en casetes histológicos que contengan concentraciones crecientes de etanol, durante una hora por concentración. Después de la segunda inmersión de etanol, transfiera las muestras al xileno para dos inmersiones de una hora, antes de transferir los casetes a 60 grados Celsius parafina líquida en una campana química durante la noche para permitir que el xileno se evapore.
A la mañana siguiente, coloque las muestras deshidratadas con la corona y las raíces orientadas paralelas a la parte inferior del molde, en una máquina de bloqueo histológico para incrustar las muestras en la parafina. Para obtener secciones, fije la muestra del bloque de parafina en el bloque de corte de microtonos y recorte la muestra hasta que se alcance el tejido de interés. Cuando cualquier parte del diente es visible, comience a obtener secciones de seis micrómetros de espesor, ajustando el ángulo de corte hasta obtener secciones sagitales que incluyen la pulpa coronal y radicular y el foramen apical.
Aquí, se muestra toda una mandíbula tratada. La ampliación del primer molar derecho tratado, permite la observación de la exposición de los cuernos de pulpa mesial y distal y la entrada a los canales. Las imágenes micro-CT permiten la visualización de la exposición a la pulpa mesial, y las áreas radiolúcidas periapicales mesiales y distales de la reabsorbencia ósea.
De hecho, se mide una reabsorbción ósea periapical significativa del volumen tisular en los dientes tratados, en comparación con los controles. El análisis histológico indica que en el diente tratado, la pulpa dental en sí presenta necrosis, que se puede observar claramente después de la tinción H y E en comparación con el control del tejido pulpar organizado. Además, y lo que es más importante, en la región periapical del diente tratado, se observa una lesión periapical compuesta de células inmunitarias, que está ausente en los dientes de control.
Es vital colocar el ratón correctamente durante la exposición a la pulpa ya que un posicionamiento correcto permite un buen acceso a la boca del animal y resultados óptimos. Se pueden realizar métodos adicionales de análisis de inflamación periapical como la tinción de tejido inmunohistoquímico y el fax y el análisis molecular detallado de las células siguiendo este protocolo. Este protocolo es significativo, no sólo para la investigación dental, sino también para la investigación inmunológica, ya que proporciona un modelo para la inflamación inducida local con un control interno incorporado.
