Estos estudios tienen como objetivo proporcionar sistemas modelo robustos y reproducibles para realizar estudios específicos de orientación del epitelio intestinal. Los organoides apicales se pueden generar en grandes cantidades y son prometedores para la detección de alto rendimiento. Las monocapas son más fáciles de manipular y ofrecen acceso a signos apicales y basales.
Asegúrese de que el tamaño de los organoides es de 150 a 250 micrómetros de diámetro antes de comenzar el protocolo de inversión. Retire y deseche cuidadosamente el medio de cada pozo que contenga organoides sin interrumpir la cúpula de ECM. Agregue un mililitro de solución de disociación helada a cada pozo e incube la placa a temperatura ambiente durante un minuto.
Desaloje cuidadosamente las cúpulas pipeteando lentamente con una punta recubierta, teniendo cuidado de no interrumpir y fragmentar los organoides. Transfiera la suspensión organoide a una placa tratada con solución antia adherencia y coloque la placa en una coctelera a cuatro grados Centígrados durante 30 minutos. Después de 30 minutos retire la placa y pipetee suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo usando una punta de pipeta de un mililitro recubierta con solución anti adherencia.
Coloque el plato en la coctelera a cuatro grados centígrados durante otros 30 minutos. Retire la placa y deje que los organoides se asienten por gravedad durante uno o dos minutos a temperatura ambiente. Después de que los organoides se asienten, retire la mayor cantidad posible de la solución de disociación y lávelos agregando 1,5 mililitros de DMEM F-12.
Deje que los organoides se sedimenten y eliminen el sobrenadante. A continuación, repita el lavado. Retire la mayor cantidad posible del DMEM F-12 y agregue 0.5 mililitros de medio de expansión organoide intestinal.
Incubar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente realice un cambio parcial de medio inclinando la placa en un ángulo de 25 a 30 grados y eliminando el medio a lo largo de la pared del pozo teniendo cuidado de no eliminar los organoides suspendidos. Añadir 0,4 mililitros de medio de expansión organoide intestinal e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres días.
Si se han formado agregados, utilice una punta de pipeta de un mililitro recubierta con solución antia adherente para esquilear los agregados pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces mientras presiona el extremo de la punta hasta la parte inferior de la placa. Agregue un mililitro de 0.05% Tripsina-EDTA precalentado a los organoides resuspend. Y mezclar bien para asegurar una suspensión uniforme.
Sume un mililitro adicional de Tripsina-EDTA para un gran número de células, o si queda una cantidad significativa de ECM. Incubar a 37 grados Centígrados durante cinco a 10 minutos, luego mezclar bien con una pipeta de un mililitro para interrumpir los organoides para que estén completamente disociados en células individuales o pequeños fragmentos. Para disociar completamente fragmentos u organoides enteros continuar la incubación con Tripsina-EDTA a 37 grados Centígrados durante otros tres a cinco minutos.
Una vez que los organoides estén suficientemente disociados añadir un volumen igual de DMEM F-12 y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar a fondo. Inactivar la tripsina-EDTA mediante la adición de 10% FBS a las células. Fragmentos de centrífuga a 200 veces G durante cinco minutos a dos a ocho grados centígrados.
Si los organoides disociados no pudieron peletizar las células a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y centrifugarlas de nuevo. Retire con cuidado tanto sobrenadante como sea posible. dejando sólo el pellet celular.
Resuspend las células en 100 microlitros de medio de diferenciación organoide intestinal para cada pozo a sembrar. Ajustar el volumen adecuadamente para tamaños de pozo más grandes o más pequeños. Retire las placas recubiertas de la incubadora y retire el exceso de solución de matriz de membrana basal de cada pozo.
Añadir 100 microlitros de la suspensión celular al pozo superior de cada inserto de cultivo celular y 500 microlitros de medio de diferenciación organoide intestinal al pozo inferior. Luego incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Substituya el medio en los pozos superior e inferior cada dos o tres días.
Para establecer un cultivo de LPA, retire el medio de los pozos superior e inferior, y agregue el medio de diferenciación organoide intestinal fresco al pozo inferior dejando el pozo superior vacío. Los organoids intestinales cultivados con el medio intestinal de la extensión del organoid exhibieron una morfología enquistada. Cuando se quita ecm algunos organoids tienden a agregar durante los primeros tres días y necesitan ser esar en para aumentar el número organoide.
Los organoids intestinales cultivados en ECM continuaron ampliándose y exhibiendo la formación espontánea de estructuras de florecimiento secundarias. Organoids mantenido por cinco días en la ausencia de matriz extracelular exhibió formas alargadas, enquistadas, e irregulares. La expresión de marcadores atípicos, como villin y ZO-1 se detectó el lado externo del epitelio que fue expuesto al medio.
Ecm embebido organoids manchados para los núcleos, villin, y ZO-1 que demostraba una polaridad básica apical donde el lado apical hacía frente al lumen del organoid. Una vez establecida la monocapa las células formaron uniones estrechas y una capa confluente. La capa confluente también orienta su borde de cepillo que contiene villín hacia el lado apical del epitelio, formando complejos multiproteicos ZO-1 entre las células.
La transición a una cultura de ALI indujo la diferenciación adicional con las células más prominentes del cáliz que fue visualizada manchando para la proteína secretada MUC2 de la mucina para inducir la inversión de la polaridad es crucial quitar todo el ECM sin interrumpir o fragmentar los organoids. Los cambios en los medios también deben hacerse con cuidado para evitar la eliminación de cualquiera de los organoides suspendidos. Asegurar que haya suficientes células individuales para el establecimiento del cultivo de monocapa es un determinante importante de su calidad.
Las funciones específicas apicales, como la absorción de nutrientes o las interacciones de patógenos del huésped, ahora pueden estudiarse en sistemas relevantes que se adapten a las necesidades de los investigadores.
