Los ecosistemas costeros y marinos son importantes como reservorios, para eliminar el nitrato de los ecosistemas terrestres. El nitrato en el medio acuático puede ser consumido por varios procesos simultáneamente. Como la desnitrificación, anammox y DNRA.
Mientras que estudios anteriores han demostrado que DNRA es potencialmente culpable de la desnitrificación, estudios que miden la actividad de DNRA como todavía muy limitado en comparación con los que miden la desnitrificación. En nuestro protocolo, proporcionamos un procedimiento detallado para la medición de la tasa potencial de DNRA en muestras ambientales. Creemos que la tasa potencial de DNRA se puede calcular a partir de la acumulación de amonio etiquetada N15 con N15 etiquetado adición de nitrato.
La ventaja de nuestro método en comparación con otros métodos, es que el amonio se convierte en última instancia en óxido nitroso, que tiene un bajo fondo atmosférico. Tampoco es prudente que medimos el óxido nitroso a través del espectrómetro de masas de cromatografía de gases cuadrúpedo. Que es menos costoso y fácil de manejar que un espectrómetro de masas de relación isótopo.
En primer lugar, coloque una pieza de 60 milímetros de cinta de PTFE en una pequeña hoja de papel de aluminio. Ceniza un filtro de fibra de vidrio a 450 grados Celsius durante cuatro horas en un horno de mufla. A continuación, coloque el filtro de fibra de vidrio un poco por encima del punto medio del eje más largo de la cinta.
A continuación, detecte 20 microlitros de 0,9 moles por litro de ácido sulfúrico en el centro del filtro de fibra de vidrio, y doble inmediatamente la cinta de PTFE utilizando sello plano y pinzas rectas. Voltee la cinta de PTFE sobre el filtro de fibra de vidrio, luego selle ambos lados de la cinta de PTFE doblando y luego presionando firmemente el borde con las pinzas. Con las pinzas, doble el extremo abierto de la cinta de PTFE y presione el borde.
Selle el extremo abierto de la cinta de PTFE presionando firmemente el borde con las pinzas, teniendo cuidado de no presionar el filtro de fibra de vidrio. Transfiera 30 miligramos de óxido de magnesio cenizado a un vial de vidrio de 20 mililitros y coloque el sobre de PTFE en el vial. Transfiera cinco mililitros de una muestra o estándar previamente preparado al vial que contiene el óxido de magnesio y la envolvente de PTFE.
Y cierre inmediatamente el vial con un tapón de goma de butilo gris. A continuación, selle el vial con una tapa de aluminio. Agitar los viales a 150 RPM durante tres horas a cuatro grados centígrados en condiciones oscuras.
Después de esto, retire la tapa de aluminio y el tapón de goma de butilo de cada vial. Retire el sobre de PTFE de cada vial con pinzas de punto terminado, y enjuague bien el sobre y las pinzas con agua intercambiada por iones. Luego, limpie el sobre y las pinzas con papel de limpieza, y coloque el sobre en papel de limpieza fresco.
Abra el sobre de PTFE con pinzas planas y puntiagudas en orden inverso de los escalones de plegado. Usando pinzas planas, sostenga el área periférica del filtro de fibra de vidrio, donde se supone que el ácido sulfúrico no se absorbe. Y transfiéralo a un tubo de prueba de tapa de tornillo de 11 milímetros.
Enjuague las pinzas con agua intercambiada de iones y límpielas con papel de limpieza. Agregue un mililitro de agua intercambiada por iones a cada tubo de ensayo. Cierre los tubos de ensayo con tapones de tornillo forrados con PTFE y déjales reposar durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, para eludir completamente el catión de amonio del filtro de fibra de vidrio.
Después de esto, abra la tapa del tornillo, agregue dos mililitros de un reactivo de solución oxidante de persulfato previamente preparado al tubo de ensayo, y cierre el tubo firmemente con una tapa de tornillo, para evitar cualquier pérdida o contaminación durante los siguientes pasos. Coloque los tubos de ensayo en un bastidor, envuélvalos en papel de aluminio de doble capa y autoclavelos en posición vertical durante una hora a 121 grados centígrados. Mezclar 100 mililitros de 40 milimolemols estériles por litro de tampón de fosfato, y 100 mililitros de glucosa estéril de 30 milimolemols por litro de glucosa asépticamente.
Añadir un stock de glicerol de P.chlororaphis a 200 mililitros de la solución de glucosa tamponada de fosfato, en un matraz Erlenmeyer de 300 mililitros. Y purga con un flujo de helio ultra puro durante una hora. A continuación, dispensar dos mililitros de una suspensión de desnitrificador previamente preparada en viales de cinco mililitros.
Tapa cada vial con un tapón de goma de butilo gris, y un cierre de aluminio. Sustituya el aire Headspace por helio ultra puro, aspirando durante tres minutos y cargando el helio durante un minuto. Ajuste la presión positiva del gas Headspace a 1,3 atmósferas, para evitar la contaminación involuntaria del aire.
Inyecte un mililitro de una muestra o estándar a través del tapón de goma de butilo, utilizando una jeringa desechable de un mililitro. Luego, incubar los viales durante la noche a 25 grados centígrados, en condiciones oscuras. Al día siguiente, inyectar 0,3 mililitros de seis moles por litro de hidróxido de sodio para detener la desnitrificación y absorber el dióxido de carbono Headspace, que de lo contrario perturbará el análisis de óxido nitroso.
Porque el dióxido de carbono y el óxido nitroso tienen el mismo peso molecular. Determinar las cantidades de óxido nitroso con un peso molecular de 44, 45 y 46, en el gas Headspace utilizando cuadrúpedo GC/MS con un puerto de inyección modificado. Los resultados representativos se derivaron de 15 experimentos de rastreo de nitrógeno de sedimentos de marismas de sal creados a partir del Gran Terremoto del Este de Japón de 2011 en el área lunar de la ciudad de Kesennuma y la prefectura de Miyagi, Japón.
Se observó un aumento de la concentración de amonio etiquetado durante todo el período de incubación de todos los sedimentos recogidos en las zonas submareales e intermareales. Las tasas de DNRA estaban dentro del rango de 24,8 a 177. Y son comparables a los valores reportados en estudios anteriores, pero más altos que los valores derivados de entornos similares.
La alta tasa de DNRA, puede explicarse por la marisma que se utiliza como campo de cultivo antes del terremoto. De acuerdo con la especulación, la tasa de DNRA en la zona intermareal, que es rica y compuestos orgánicos en comparación con la zona submareal, fue mayor. Nuestro protocolo es ampliamente aplicable al análisis de vías metabólicas, que implica la formación de amonio y adiciones de trazas N15.
