El objetivo general de este procedimiento es mejorar los estudios secundarios de neumonía bacteriana proporcionando una vía simple y no invasiva de inoculación bacteriana en el tracto respiratorio inferior seguido de recuperación bacteriana y purificación de ARN para el análisis de transcripción. Esto se logrará primero anestesiando profundamente un ratón e insertando una aguja doblada con puntas contundentes precargada en la tráquea de un ratón que ha sido suspendida verticalmente de los incisivos maxilares. En segundo lugar, después de una infección exitosa, las unidades bacterianas formadoras de colonias se recuperan por escisión y homogeneización de los pulmones.
El homogeneato pulmonar resultante se diluye en serie y se encuina en el agar nutritivo para enumerar las unidades formadoras de colonias. Por último, el ARN se purifica a partir del homogeneizado pulmonar. Las ventajas de este procedimiento es que permite un parto controlado directamente en el tracto respiratorio inferior.
Esto nos permite examinar tanto las contribuciones combinatorias como las individuales del patógeno hacia el resultado de la enfermedad. Los avances recientes en este campo han demostrado que la regulación de genes bacterianos puede tener un papel importante en la determinación del resultado de la infección. Esta técnica se beneficia de la capacidad de recuperar tanto las UFC bacterianas como el ARN.
Una vez que el ARN está aislado, podemos evaluar las contribuciones de genes de virulencia específicos hacia la infección. Además, esta técnica se beneficia de ser no quirúrgico. Esto permite un tensión mínima en cualquier animal utilizado dentro de este procedimiento y les permite tener una recuperación inmediata.
Este procedimiento se beneficia del uso de equipos de laboratorio comunes sin el uso de ningún tipo de cánulas, cables guía o cables de fibra óptica. Individuos nuevos en esta técnica pueden luchar al principio con la instalación real a través de la tráquea. Una vez que esta técnica se conceptualiza, se convierte en un procedimiento simple y eficaz para interrogar la neumonía bacteriana secundaria dentro de un huésped murino.
Antes de comenzar el procedimiento, prepare el espacio de trabajo con los siguientes suministros: una plataforma de intubación, una jeringa estéril de un ml, fórceps estériles con puntas romas, aguja estéril de punta contundente de calibre 21 y dos tubos cónicos para almacenar la jeringa y los fórceps. Comience el procedimiento preparando los inóculos patógenos para obtener la concentración final deseada en un volumen de 50 microlitros. A continuación, con guantes estériles, prepare una aguja de punta contundente de calibre de 1,5 pulgadas y 21 doblándola a un ángulo aproximado de 35 grados.
Después de fijar la aguja a la jeringa, extraiga un cojín de aire de 100 microlitros, seguido de 50 microlitros del agente infeccioso. El cojín de aire de 100 microlitros garantiza la entrega completa de la carga del patógeno una vez que la jeringa está deprimida. Coloque la aguja y la jeringa cargadas en un lugar de fácil acceso con la mano dominante.
Retire y anestesice el ratón de la cámara de anestesia y suspenda el ratón en la plataforma de intubación de los incisivos maxilares. Usando los fórceps de punta contundente, agarre suavemente y extienda la lengua. Transfiera la lengua de las fuerzas al pulgar hacia el pulgar y el dedo índice de la mano no dominante.
Permanezca sosteniendo la lengua en la mano nonteminante y recoja la jeringa precargada. Apunte el extremo doblado de la aguja lejos del cuerpo. Inserte la aguja en la cavidad oral.
En la base de la lengua ángulo suavemente la muñeca para causar un ligero empuje de la aguja lejos del cuerpo. Esta acción asegura que la aguja se inserte en la tráquea y no en el esófago. Guía lentamente la aguja hacia abajo en la tráquea.
A menudo se siente una ligera garrapata a medida que la aguja pasa a través del pliegue vocal. Pase la aguja a través de la tráquea hasta que se sienta una ligera resistencia mientras la aguja encuentra la carina. Levante ligeramente la aguja en la dirección ascendente para suspender la aguja por encima de la carina.
Esto permite la entrega en los bronquios primarios. Presione completamente el émbolo de la jeringa para entregar la carga infecciosa. Retire la aguja de la tráquea y deseche.
Retire el ratón de la plataforma de intubación presionando la banda de goma, pero mantenga el ratón en posición vertical. Obstruya las vías respiratorias nasales colocando un dedo directamente sobre las narinas. Mantenga esta posición durante aproximadamente un minuto o hasta que se observen varias respiraciones profundas.
Este último paso asegura que el volumen total de inóculo se entregue en el tracto respiratorio inferior. Devolver el animal a su jaula y asegurarse de que hay una pronta recuperación de la anestesia. En puntos de tiempo seleccionados después de la infección, los pulmones infectados pueden extirparse para cuantificar y evaluar las contribuciones bacterianas al aumento de las morbilidades asociadas con la neumonía bacteriana secundaria.
Prepare un espacio de trabajo con los siguientes artículos: una báscula y un bote de pesaje estéril, una plataforma de disección, un kit de disección que contenga tijeras y fórceps, y gasa estéril. A los efectos de esta demostración, la escisión de los pulmones se realizará en un banco. Sin embargo, con el fin de mantener la esterilidad durante todo este procedimiento se recomienda que la escisión pulmonar se realice dentro de una campana de flujo laminar.
Eutanasia un ratón infectado con CO2 o método similar aprobado por la IACUC de eutanasia. Coloque y asegure el ratón infectado en la plataforma de disección. Rocíe el ratón con etanol para mantener la esterilidad en las superficies de trabajo.
Comenzando en el umbilicus, usa un par de fórceps para levantar la piel y hacer una incisión hacia la laringe. Agarrar la piel a ambos lados de la incisión inicial, alejar la piel del cuerpo y cortar a través de las conexiones del tejido. Puede ser útil hacer cortes laterales a través de la piel para revelar más de la región torácica.
Comenzando en la base del proceso de xifoide, hacer una pequeña incisión con la intención de perforar el diafragma. Esto resulta en un aumento de la presión en la cavidad torácica haciendo que los pulmones se retraigan. Con los pulmones retraídos, continúe la incisión para liberar el diafragma.
Retire las costillas haciendo una incisión a cada lado. Esto expondrá la cavidad torácica y los pulmones. Para extirpar los pulmones, agarra la base del corazón con los fórceps y levanta hacia arriba.
Coloque las tijeras detrás de los pulmones y comience a hacer pequeñas incisiones a través de las conexiones del tejido mientras continúa levantando el corazón hacia arriba. Una vez que los pulmones han sido extirpados, colóquelos en una gasa estéril y retire el corazón levantándolo de los pulmones y cortando las conexiones de tejido restantes. Transfiera los pulmones al bote de pesaje pre-tared y registre la masa.
Después de que los pulmones han sido pesados, transfiera los pulmones a solución salina estéril con fosfato y guárdelos temporalmente en hielo. Ahora que los pulmones han sido extirpados y pesados, las bacterias se pueden recuperar para determinar su papel hacia la patogénesis. En preparación para la recuperación bacteriana, se necesitarán los siguientes suministros: un molinillo de tejido, PBS estéril libre de RNase, Tampón RLT complementado con beta-mercaptoetanol, y 1,5 ml de tubos de microcentrífuga sin RNase.
Comience agregando primero un ml de PBS estéril libre de RNase a la trituradora de tejido. Una vez rellenada, guarde la trituradora de tejido en hielo. A continuación, prepare una serie de tubos de dilución en serie estériles libres de RNase para cuantificar la carga bacteriana recuperada de los pulmones infectados.
Transfiera los pulmones a la trituradora de tejido preparada y homogeneice a fondo el tejido presionando hacia abajo en el pedestal mientras gira. Abra la amoladora de tejido y aliquot 100 microlitros de la muestra homogeneizada en el primero de los tubos de dilución serie preparados. Diluir en serie las muestras y la placa en el agar nutritivo para enumerar las unidades formadoras de colonias.
Las UFC se pueden registrar como UFC por ml o UFC por ml, por miligramo de tejido pulmonar. Después de que se haya eliminado la alícuota de 100 microlitr, sustituya el pedestal de molienda y centrifuga la muestra a 4.000 rpm durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez completada la centrifugación, retire el sobrenadante de la muestra peletada.
El sobrenadante se puede guardar y almacenar a menos 80 grados Centígrados para su posterior análisis en una fecha posterior. Re-suspenda el pellet de tejido homogeneizado en 700 microlitros de RLT beta-mercaptoetanol y transfiera la muestra a un tubo de centrífuga estéril sin RNase de 1,5 ml. En este punto, la muestra se puede almacenar a menos 80 grados.
El ARN se puede purificar a partir de la suspensión homogeneiza pulmonar RLT cargando la muestra en un tubo de microcentrífuga de dos ml que contiene perlas de sílice de 1 milímetro y se procesa a través de un batidor de perlas durante 20 segundos a seis metros por segundo. El ARN se purifica inmediatamente utilizando una adaptación del método RNeasy como se indica en Voyich, et al. Métodos de Biología Molecular"2008, y descritos en el manuscrito que acompaña a este video.
Después de la purificación, el rendimiento del ARN se puede cuantificar utilizando un espectrofotómetro. Una vez cuantificado, es beneficioso diluir el ARN resultante en varias alícuotas de 50 nanogramos por microlitro. Esto permite que el ARN de la muestra se utilice para múltiples análisis sin estar sujeto a múltiples ciclos de congelación-descongelación.
El uso de esta técnica permite la instalación de una carga de patógenos controlado directamente en el tracto respiratorio inferior. La eficiencia de este sistema de entrega se puede demostrar mediante la instalación de una solución azul brillante 1%Coomassie. La fila superior muestra un par de pulmones no infectados para servir como control, mientras que la fila inferior muestra un par de pulmones que han recibido 50 microlitros del 1%Coomassie brillante tinte azul a través de una instalación intratraqueal.
El uso de este tinte demuestra cómo la instalación intratraqueal proporciona una distribución uniforme de la carga del patógeno dentro y a través de los pulmones izquierdo y derecho. Una vez infectada, la carga del patógeno se puede recuperar y analizar en varios puntos de tiempo después de la instalación intratraqueal por escisión y homogeneización del tejido pulmonar. Para demostrar la eficiencia de esta técnica de recuperación, dos grupos que contenían tres ratones cada uno se infectaron con una dosis baja y alta de Staphylococcus aureus.
La entrada bacteriana fue chapada en agar nutritivo para enumerar las UFC. Una hora después de la instalación intratraqueal, los ratones fueron eutanasiados, los pulmones extirpados y homogeneizados en una trituradora de tejido. El tejido homogeneizado se diluyó en serie y se encuplaó en el agar nutritivo para enumerar las UFC.
El ARN aislado del tejido pulmonar homogeneizado puede examinarse mediante la PCR de la transcriptasa inversa y utilizarse para cuantificar la abundancia relativa de transcripción de genes diana. Para garantizar una contaminación mínima del ADN de fondo, se recomienda que una reacción PCR, sin la adición de transcriptasa inversa, se ejecute junto con cualquier reacción qRT-PCR. Además de las cargas bacterianas, esta técnica se puede extender a la instalación y aislamiento de cargas virales.
Después de la homogeneización del tejido pulmonar, el ARN viral se puede aislar y utilizar para medir la abundancia de transcripción de genes virales o construir una curva estándar para la cuantificación viral. El uso de este sistema proporciona un sistema altamente eficiente y reproducible para estudiar la neumonía bacteriana secundaria. Una vez masterado, este procedimiento se puede utilizar en experimentos a gran escala.
Trabajando en lotes para eutanasiar ratones, la instalación intratraqueal puede ocurrir dentro de 30 segundos por ratón. Después de esto se completa, pasando a la escisión de los pulmones, esto se puede completar en aproximadamente dos a tres minutos por ratón. Si bien los métodos discutidos aquí habían sido dentro del contexto de una infección bacteriana secundaria, pueden extenderse hacia cualquier procedimiento donde sea necesario un parto controlado y la recuperación de un inóculo.
Además de los métodos descritos aquí, este procedimiento se puede complementar con la adición de un lavado broncoalveolar antes de la escisión de los pulmones. Mientras que esto a menudo resulta en una disminución de la recuperación de la carga de patógenos, se beneficia de la obtención de datos, como el análisis de citoquinas, la actividad de lactato deshidrogenasa, y la identificación de diferentes poblaciones celulares. Para obtener una comprensión más completa de la patogénesis de la enfermedad se hace importante interrogar tanto las contribuciones del huésped como de los patógenos a la enfermedad.
El propósito de este video era proporcionar un método simple y eficiente para explorar la neumonía bacteriana secundaria dentro de un huésped murino.
