Общая цель этой процедуры заключается в повышении вторичных исследований бактериальной пневмонии, предоставляя простой и неинвазивный маршрут бактериальной прививки в нижних дыхательных путях с последующим бактериальным восстановлением и очисткой РНК для анализа стенограммы. Это будет достигнуто путем первого глубоко анестезии мыши и вставки предварительно загруженных тупо наконечником изогнутой иглы в трахею мыши, которая была вертикально приостановлено от челюстно-максисторов. Во-вторых, после успешной инфекции бактериальные колониообразующие единицы восстанавливаются путем иссечения и гомогенизации легких.
Полученный гомогенат легких последовательно разбавляется и помылся питательным агаром, чтобы перечислить колониообразующие единицы. Наконец, РНК очищается от гомогената легких. Преимущество этой процедуры заключается в том, что она позволяет осуществлять контролируемую доставку непосредственно в нижние дыхательные пути.
Это позволяет нам взглянуть как на комбинаторный, так и на индивидуальный вклад патогена в исход заболевания. Недавние достижения в этой области показали, что регуляции бактериальных генов могут играть большую роль в определении исхода инфекции. Этот метод выигрывает от способности восстановить как бактериальные CFUs, а затем РНК.
После того, как РНК изолирована, мы можем оценить вклад конкретных генов вирулентности в инфекцию. Кроме того, этот метод выигрывает от нехирургических. Это позволяет снять минимальный стресс на животных, используемых в рамках этой процедуры, и позволяет им иметь немедленное выздоровление.
Эта процедура выигрывает от использования общего лабораторного оборудования без использования любого типа канюли, направляющий провод или волоконно-оптических кабелей. Индивидуалы новые к этому методу могут бороться во-первых с фактической установкой через трахею. Как только этот метод концептуализирован, он становится простой и эффективной процедурой для допроса вторичной бактериальной пневмонии в murine хозяина.
Перед началом процедуры подготовьте рабочее пространство со следующими принадлежностями: интубационная платформа, стерильный шприц с одним мл, стерильные тупые хлипки, стерильные 21-го калибра тупой иглы и две конические трубки для хранения шприца и типсов. Начните процедуру с подготовки патогенных инокулем, чтобы желаемая окончательная концентрация была получена в объеме 50 микролитров. Далее, используя стерильные перчатки подготовить один до 1,5 дюйма 21-го калибра тупой наконечником иглы, согнув его до приблизительного 35 градусов угол.
После фиксации иглы к шприцу нарисуйте 100 микролитровую воздушную подушку, за которой последуют 50 микролитров инфекционного агента. Воздушная подушка 100 микролитров обеспечивает полную доставку патогенной нагрузки после депрессии шприца. Поместите загруженную иглу и шприц в место, легкодоступное доминирующей рукой.
Удалите и обезболить мышь из наркозной камеры и приостанавливайте мышь на интубации платформы из челюстно-максиллярных резцев. Используя тупые типсы, аккуратно схватите и расширите язык. Перенесите язык из типсов в большой палец и указательный палец недоминантной руки.
Оставайтесь, держа язык в недоминантной руке и возьмите предварительно загруженный шприц. Навечь согнутый конец иглы подальше от тела. Вставьте иглу в полость рта.
В основании языка осторожно угол запястья, чтобы вызвать небольшой толчок иглы от тела. Это действие гарантирует, что игла будет вставлена в трахею, а не в пищевод. Медленно направляйте иглу вниз в трахею.
Часто небольшой тик ощущается, как игла проходит через вокальные раза. Перейдите иглу через трахею, пока небольшое сопротивление ощущается, как игла сталкивается с кариной. Слегка поднимите иглу в восходящем направлении, чтобы приостановить иглу над кариной.
Это позволяет доставки в первичных бронхов. Полностью угнетайте поршень шприца, чтобы доставить инфекционную нагрузку. Снимите иглу с трахеи и отбросьте.
Удалите мышь с платформы intubation, угнетая резинку, но поддерживать проведение мыши в вертикальном положении. Помешать носовых дыхательных путей, поместив палец прямо над nares. Держите эту позицию в течение примерно одной минуты или до тех пор, пока несколько глубоких вдохов наблюдаются.
Этот последний шаг гарантирует, что общий объем инокулы доставляется в нижние дыхательные пути. Верните животное в клетку и убедитесь, что есть быстрое восстановление после анестезии. В выбранные моменты времени после заражения инфицированные легкие могут быть вырезаны для количественной оценки и оценки бактериального вклада в увеличение заболеваемости, связанной со вторичной бактериальной пневмонией.
Подготовь рабочее пространство со следующими предметами: масштаб и стерильная лодка взвешивания, платформа для вскрытия, комплект для вскрытия, содержащий ножницы и типсы, и стерильная марля. Для целей этой демонстрации иссечение легких будет выполняться на скамейке сверху. Однако, для того, чтобы сохранить стерильность на протяжении всей этой процедуры рекомендуется, чтобы иссечение легких быть выполнены в ламинарный капюшон потока.
Эвтаназия инфицированной мыши с ПОМОЩЬю CO2 или аналогичного одобренного МАКУК метода эвтаназии. Поместите и защитите зараженную мышь на платформе вскрытия. Спрей мыши с этанолом для поддержания стерильности на рабочих поверхностях.
Начиная с умбиликуса, используйте парные тиски, чтобы поднять кожу и сделать разрез к гортани. Схвив кожу по обе стороны от первоначального разреза, вытяните кожу от тела и прорезать ткани соединений. Это может быть полезно, чтобы сделать боковой сокращений по всей коже, чтобы выявить больше грудной области.
Начиная с основания процесса xiphoid, сделать небольшой разрез с намерением прокола диафрагмы. Это приводит к повышению давления в грудной полости вызывает легкие втягиваться. С легкими втягивается, продолжить разрез, чтобы освободить диафрагму.
Удалите ребра, сделав разрез с обеих сторон. Это позволит разоблачить грудной полости и легких. Чтобы подакциз легкие схватить основание сердца с типсами и поднять вверх.
Поместите ножницы за легкие и начать делать небольшие разрезы через ткани соединения, продолжая поднимать сердце вверх. После того, как легкие были вырезаны, поместите их на стерильную марлю и удалить сердце, подняв его из легких и резки оставшихся связей тканей. Перенесите легкие на предварительно смоляную весятую лодку и завемите массу.
После того, как легкие были взвешены, перенесите легкие в стерильный фосфат-буферный солевой раствор и временно храните их на льду. Теперь, когда легкие были вырезаны и взвешены, бактерии могут быть восстановлены, чтобы определить их роль в патогенеза. В рамках подготовки к восстановлению бактерий, следующие поставки будут необходимы: ткань шлифовальная станка, стерильные RNase-бесплатно PBS, буфер RLT дополняется бета-меркаптоэтанол, и 1,5 мл RNase-бесплатно микроцентрифуг труб.
Начните с первого добавления одного МЛ стерильных RNase свободной PBS в ткань шлифовальной машины. После заполнения, хранить ткань шлифовальной машины на льду. Далее, подготовить серию стерильных RNase свободных серийных труб разбавления для количественной оценки бактериальной нагрузки, извлеченной из инфицированных легких.
Передача легких в подготовленную ткань шлифовальной машины и тщательно гомогенизировать ткани, нажав на пьедестал во время вращения. Откройте тканевую шлифователь и aliquot 100 микролитров гомогенизированного образца в первый из подготовленных серийных разбавленных трубок. Серийно разбавляют образцы и тарелку на питательном агаре, чтобы перечислить колониообразующие единицы.
CFUs можно можно писано как CFUs в mL или CFUs в mL, в миллиграмм ткани легкя. После того, как 100 микролитер aliquot был удален, заменить шлифовальный пьедестал и центрифуги образца на 4000 об / мин в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Когда центрифуга будет завершена, удалите супернатант из гранулированного образца.
Супернатант может быть сохранен и сохранен при температуре минус 80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа на более поздний срок. Повторно приостанавливайте гранулы гомогенизированной ткани в 700 микролитров бета-меркаптоэтанола RLT и перенесите образец в стерильную без rNase 1,5 мл центрифугную трубку. На данный момент образец может храниться при минус 80 градусах.
РНК может быть очищена от однородной суспензии легких RLT путем загрузки образца в двух мл микроцентрифуг трубки, содержащей 1 миллиметр кремнезема бусы и обрабатываются с помощью бисера загонщик в течение 20 секунд на шесть метров в секунду. РНК затем немедленно очищается с помощью адаптации метода RNeasy, как сообщается в Voyich, и др. Методы молекулярной биологии"2008, и описано в рукописи, сопровождающей это видео.
После очистки урожайность РНК можно количественно оценить с помощью спектрофотометра. После количественной оценки полезно разбавить полученную РНК на несколько алицитов по 50 нанограмм на микролитер. Это позволяет использовать РНК из выборки для нескольких анализов, не подверженной множественным циклам замораживания-оттепели.
Применение этого метода позволяет установить контролируемую патогенную нагрузку непосредственно в нижние дыхательные пути. Эффективность этой системы доставки может быть продемонстрирована путем установки 1%Coomassie блестящее синее решение. Верхний ряд отображает пару неинфицированных легких, чтобы служить в качестве контроля, в то время как нижний ряд отображает пару легких, которые получили 50 микролитров 1%Coomassie блестящий синий краситель через интратрахеальной установки.
Использование этого красителя демонстрирует, как интратрахеальная установка обеспечивает равномерное распределение патогенной нагрузки в левое и правое легкие. После инфицирования возбудительная нагрузка может быть восстановлена и проанализирована в различных точках времени после интратрахеальной установки путем иссечения и гомогенизации легочной ткани. Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода восстановления две группы, содержащие три мышей каждый были инфицированы низкой и высокой дозой золотистого стафилококка.
Бактериальный вход был помын на агаре питательных веществ, чтобы перечислить CFUs. Через час после внутритрахальной установки мышей усыпали, легкие вырезали и гомогенизировали в мясорубке. Гомогенизированная ткань была последовательно разбавлена и помына питательным агаром для перечисления CFUs.
РНК, изолированная от однородной ткани легких, может быть исследована с помощью обратной транскриптазы ПЦР и использована для количественной оценки относительного обилия генов-мишеней. Для обеспечения минимального загрязнения фоновой ДНК рекомендуется, чтобы реакция ПЦР, без добавления обратной транскриптазы, запускалась вместе с любыми реакциями qRT-PCR. В дополнение к бактериальным нагрузкам, этот метод может быть распространен на установку и изоляцию вирусных нагрузок.
После гомогенизации легочной ткани, вирусная РНК может быть изолирована и использована для измерения обилия транскрипта вирусных генов или построения стандартной кривой для вирусной количественной оценки. Использование этой системы обеспечивает высокоэффективную и воспроизводимую систему для изучения вторичной бактериальной пневмонии. После освоения эта процедура может быть использована в крупномасштабных экспериментах.
Работая партиями для усытворять мышей, внутритрахальная установка может происходить в течение 30 секунд на мышь. После того, как это будет завершено, переходя к иссечению легких, это может быть завершено примерно за две-три минуты на мышь. Хотя обсуждаемые здесь методы были в контексте вторичной бактериальной инфекции, они могут быть распространены на любую процедуру, при которой необходима контролируемая доставка и восстановление инокулума.
В дополнение к описанным здесь методам, эта процедура может быть дополнена добавлением бронхоалвеолярного лаважа до иссечения легких. Хотя это часто приводит к снижению нагрузки патогена, это выигрывает от получения данных, таких как анализ цитокинов, активность лактат дегидрогеназы, и идентификация различных клеточных популяций. Для получения более полного понимания патогенеза болезни становится важным допросить как принимающий, так и патогенный вклад в болезни.
Цель этого видео было обеспечить простой и эффективный метод для изучения вторичной бактериальной пневмонии в мурин хозяина.
