Esta investigación fue financiada por una beca de Wellcome Trust Superior otorgó a Ian Goodfellow, y una beca Marie Curie Intra Europea (7PM Consejo Europeo de Investigación) otorgado a Armando Arias. Nos gustaría dar las gracias a Io Hong Cheong, la Dra. Rebecca Robey y el Dr. Mike Skinner por darnos permiso para usar su Bioanalyser Agilent y ayudar con el funcionamiento de las muestras de ARN.

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Chem. 281, 25315-25325 (2006).</li><li>Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calicivirus+translation+initiation+requires+an+interaction+between+VPg+and+eIF+4.">Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4.</a> E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).</li><li>Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+protein+linked+to+the+genomic+and+subgenomic+mRNAs+of+feline+calicivirus+and+its+role+in+translation.">Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation.</a> J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).</li><li>Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. 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M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+optimized+RNA-based+murine+norovirus+reverse+genetics+system.">Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system.</a> J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).</li><li>Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+mutants+of+VPg+reveal+new+cytopathology+determinants+in+a+picornavirus.">Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus.</a> PLoS One. 5, e10735 (2010).</li><li>Werf, S. v. a. n. d. e. r., Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. 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No tenemos nada que revelar.

Aquí se han puesto de manifiesto dos diferentes enfoques de genética inversa que permiten la recuperación de MNV infecciosa en cultivo celular. Ambos se aproxima efectivamente omitir el requisito absoluto para el ligamiento covalente de VPg al extremo 5 &#39;del genoma viral ARN a través de la generación de cubiertas de transcripciones MNV que luego son reconocidos por los ribosomas celulares. En la transcripción in vitro seguido por enzimáticamente nivelación es más eficiente en la recuperación de MNV infeccioso que la transcripción de los plásmidos infecciosos en las células que expresan la RNA polimerasa T7, en el que las transcripciones puede estar cubierto por las enzimas FPV de tapado. Los títulos de virus recuperados con estos sistemas de ida genética son similares a los obtenidos por transfección de virales VPg ligados ARN purificados a partir de cultivos de células infectadas 17 (Figura 5). La transfección de ARN tope MNV en células permisivas RAW264.7 hace sólo un título vírico 1-registro más bajo que los experimentos que implican la transfection de RNA total de células infectadas contienen viral VPg ligado ARN (Figura 5). Este hecho alienta investigaciones adicionales para determinar si la adición de una molécula VPg al extremo 5 &#39;de los transcritos generados por estos sistemas podrían resultar en rendimientos de virus de aumento, que pueden revelar aspectos funcionales subyacentes infectividad MNV en células asociadas a VPg. Sin embargo, consideramos que este sistema de genética inversa como una alta eficiencia comparable a la de otros virus de ARN de revertir los sistemas de la genética en la actualidad en el cual el ARN transcrito in vitro permite la recuperación de los títulos de sólo 10-100 más bajos que en las infecciones reales con viriones 19, 20. En general, las metodologías actuales constituyen un importante paso adelante en el campo de la biología molecular de los norovirus y nos proporcionan las herramientas para investigar el papel funcional de las proteínas y los motivos conservados en los genomas de ARN de norovirus. Estos enfoques han sido combinadas con cmodelo de ratón urrent disponibles y han demostrado que el MNV se recuperó de cDNA infeccioso es capaz de causar una infección letal de&gt; 80% STAT1-/ - ratones en menos de 10 días 4, 21. Haciendo uso de este sistema hemos recuperado mutantes viables norovirus murino de la proteína de la cápside y de una zona polypyrimidine implicado en la unión de los diferentes factores del huésped (PTB y PCBP) que muestran un fenotipo atenuado in vivo 21, 22. Además, recientemente se ha demostrado que los virus que carecen de la capacidad de expresar la proteína VF1 de ORF4 eficientemente replicar en cultivo celular, pero de nuevo han reducido la virulencia en ratones con respecto a WT MNV 8. Estos estudios nos animan a diseñar versiones atenuadas de los norovirus humanos basados ​​en estudios de MNV que podrían ser investigados como candidatos potenciales para la vacuna.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Cloruro de litio precipitación solución </td><td> Ambion </td><td> AM9480 </td></tr><tr><td> ARN solución de almacenamiento </td><td> Ambion </td><td> AM7000 </td></tr><tr><td> Megascript T7 secuencia de comandos </td><td> Ambion </td><td> AM1333 </td></tr><tr><td> ScriptCap m7G Sistema de nivelación </td><td> Epicentro Biotecnologías </td><td> SCCE0610 </td></tr><tr><td> Sistema de transfección de neón </td><td> Invitrogen </td><td> MPK5000 </td></tr><tr><td> Transfección de neón kit de sistema de </td><td> Invitrogen </td><td> MPK1025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 transfección reactivo </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-027 </td></tr><tr><td> Agilent ARN 600 kit de Nano </td><td> Agilent </td><td> 5067-1511 </td></tr><tr><td> Agilent 2100 bioanalyzer </td><td> Agilent </td><td> G2939AA </td></tr><tr><td> Illustra GFX PCR DNA y Gel Band Purification Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9034-70 </td></tr><tr><td> RiboMAX a gran escala de ARN Sistema de Producción-T7 </td><td> Promega </td><td> P1300 </td></tr></tbody></table>

reverse genetics mediated recovery of infectious murine norovirus

Norovirus humanos son responsables de la mayoría de los casos de gastroenteritis humana (GE) en todo el mundo y son un problema recurrente en los entornos en los que cerca de persona a persona de contacto no pueden ser evitados 1, 2. Durante los últimos años un aumento en la incidencia de los brotes en hospitales se ha informado, causando trastornos significativos en su capacidad operativa, así como grandes pérdidas económicas. La identificación de nuevos enfoques antivirales se ha limitado debido a la incapacidad de los norovirus humanos para completar una infección productiva en cultivo celular 3. El aislamiento reciente de un norovirus murino (MNV), estrechamente relacionado con el norovirus humanos 4, pero que se puede propagar en las células 5 ha abierto nuevas vías para la investigación de estos patógenos 6, 7. MNV resultados de replicación en la síntesis de nuevo genómico sentido positivo y moléculas de ARN subgenómico, el último de los cuales corresponde a la última thiRD del genoma viral (Figura 1). MNV contiene cuatro diferentes marcos de lectura abierta (ORF), de los cuales ORF1 ocupa la mayor parte del genoma y codifica siete proteínas no estructurales (NS1-7) liberados de un precursor de poliproteína. ORF2 y ORF3 están contenidas dentro de la región subgenómico ARN y codificar las proteínas de la cápside (VP1 y VP2, respectivamente) (Figura 1). Recientemente, hemos identificado que ORF4 adicional superposición ORF2, pero en un marco de lectura diferente es funcional y codifica para un factor de virulencia mitocondrial localizada (VF1) 8. La replicación de los virus de ARN de sentido positivo, incluyendo los norovirus, tiene lugar en el citoplasma que resulta en la síntesis de nuevos niveladas genomas de ARN. Para promover la traducción viral, los virus explotan diferentes estrategias dirigidas a la contratación de la maquinaria de síntesis proteica celular 11.9. Curiosamente, la traducción norovirus es impulsado por el multifuncional proteína viral-cebador VPgcovalentemente al extremo 5 &#39;final de ambos RNAs genómicos y subgenómico 12-14. Este mecanismo sofisticado de la traducción es probable que sea un factor importante en la eficiencia limitada de recuperación viral mediante enfoques convencionales inversa genética. Aquí mostramos dos estrategias diferentes en función de la generación de norovirus murino-1 (conocida como la presente MNV) transcripciones de un límite máximo en el extremo 5 &#39;. Uno de los métodos implica tanto en la síntesis in vitro y la nivelación de ARN viral, mientras que el segundo enfoque implica la transcripción de MNV ADNc en células que expresan la RNA polimerasa T7. La disponibilidad de estos sistemas de genética inversa para el estudio de MNV y un modelo de animal pequeño ha proporcionado una capacidad sin precedentes para diseccionar el papel de las secuencias virales en la replicación y la patogénesis de 15-17.

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Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.

Recuperación Genética inversa mediada por norovirus murino Infecciosas

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K vistas.  Imperial College London. Los norovirus son la causa principal de gastroenteritis sin embargo, las técnicas moleculares para su caracterización son todavía relativamente nuevos. Aquí mostramos dos diferentes enfoques genética inversa para la recuperación eficiente de los norovirus murino (MNV), el único miembro de este género, que puede ser propagado en cultivos celulares.