Nos gustaría agradecer a Patrick Hayden (MatTek) útil para los debates, y Robert Smith y Perry Libby de Georgia Ciencias de la Salud de la Universidad por sus habilidades EM. Este estudio fue financiado por NIDCD conceder DC010187 de DAD

1. Preparación de la cabina de bioseguridad para los tejidos EpiAirway <ol><li> El uso de una bata de laboratorio dedicado, con el pelo recogido hacia atrás y los guantes puestos, inicie el flujo laminar. Después de 5 minutos, mover ninguna herramienta en el gabinete (pipetas, puntas, tubos de centrifugación, etc) a un lado, rociar el interior de cabinas de seguridad y la faja con 70% de etanol y limpie con toallas de papel limpias. Rocíe el interior limpia de nuevo con etanol al 70% y dejar secar. Mover las herramientas para el lado limpio y repita el procedimiento de etanol. </li><li> Use aerosoles puntas de las pipetas y pipetas barrera dedicado en el gabinete. Para utilizar envueltas individualmente Pipetas serológicas estériles, pase el extremo conectado a través del flujo laminar, se abren, y deslice la pipeta en el gabinete, descartando el exterior del embalaje. </li><li> Las inserciones EpiAirway debe ser manejado con pinzas estériles. Lugar de 6 pulgadas de punta fina Pinzas de disección curvas en bolsas de esterilización de autosellado y autoclave. Prepare suficiente para tener por lo menos seis días por listo para su uso. </li></ol> 2. Desembalaje de los tejidos EpiAirway <ol><li> Rocíe la superficie de trabajo en la cabina de bioseguridad con el 70% de etanol y limpie con toallas de papel limpias. Pulverizar de nuevo y dejar secar la superficie antes de su uso. Abra el cuadro de EpiAirway y deseche la espuma de poliestireno y material de embalaje. </li><li> El EpiAirway libre de antibióticos medio de mantenimiento, AIR-100-MM ABF (MM), es propiedad de MatTek y es enviado en el kit con los insertos. En la cabina de bioseguridad, la etiqueta seis tubos de centrífuga estéril de 50 ml con el tipo y la fecha, y aflojar las tapas. Rocíe la botella de los medios de comunicación con el 70% de etanol y abierto en el interior del gabinete. Alícuota de 25 ml de la MM en cada tubo con una nueva pipeta serológica estéril para cada tubo, apretar las tapas y almacenar a 4 ° C. Use una parte alícuota de la MM por día. </li><li> Repita el punto 2.2 con una botella de 1 X Dulbecco buffer fosfato salino (D-PBS) con calcio y magnesio. Repita de nuevo con D-PBS sin calcio y magnesio. Guarde todas las partes alícuotas a 4 ° C. </li><li> Las inserciones EpiAirway 100 habitaciones con aire llega a una placa de 24 pocillos a 4 ° C en los medios de comunicación que contienen sólidos de agarosa, y se debe colocar en placas de 6 pocillos para su uso. Etiqueta de cada placa con la fecha y la descripción mediante un marcador de etanol-resistentes. Coloca 1 mililitro de 4 ° C MM EpiAirway en cada pozo. Retire la placa de transporte de su embalaje, rociado con etanol al 70%, y el lugar en el gabinete de bioseguridad. Retire la cinta y abra la placa. El uso de pinzas autoclave, retire la gasa húmeda sobre los insertos EpiAirway. </li><li> Recoger una inserción con una pinza en autoclave mediante un movimiento de torsión para ayudar a liberarlo de la agarosa, y colocar en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Algunos de agarosa puede adherirse a la inserción, sobre todo porque la temperatura de la placa de transporte aumenta la temperatura ambiente. Use un hisopo de algodón estéril para retirar cuidadosamente la agarosa de la inserción. Evite tocar la membrana, y verificar que no queden burbujas de aire debajo de los insertos. Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Deje por lo menos 24 horas para que los tejidos se equilibren en la incubadora antes de empezar co-cultivos. </li></ol> 3. Mantenimiento de los tejidos EpiAirway <ol><li> El uso de pinzas autoclave, recoger una inserción y suavemente pipeta 200 microlitros de pre-calentado D-PBS con calcio y magnesio en el tejido y la roca de inserción. Inclinación de la inserción en un ángulo y el lugar de su punta pipeta P1000 contra el anillo de plástico que contiene la membrana en la parte inferior de la inserción. No toque los tejidos. Aspirar el D-PBS enjuague y coloque en un criovial etiquetados estéril. Las muestras pueden ser congeladas a -20 ° C y se analizó la mucina y / o la expresión de citoquinas en una fecha posterior. </li><li> Cambiar el MM basal diariamente por aspiración y el reemplazo con un mililitro de MM fresco. Utilice una punta de pipeta nueva barrera para cada pozo. El tratamiento de los medios de comunicación se utiliza con lejía al 10% durante la noche y descarte. </li></ol> 4. La inoculación de tejidos EpiAirway <ol><li> Racha de un cultivo fresco de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) de acciones de glicerol congelado en agar chocolate. Crecen durante la noche en un 5% humidificado incubadora de CO 2. </li><li> Al día siguiente, volver a suspender las colonias aisladas de HiNT en pre-calentado D-PBS con el calcio y el magnesio para una DO (600 nm) de aproximadamente 0,7. Agitar vigorosamente antes de medir la densidad óptica. La relación de la densidad óptica de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC / ml) de HiNT es que una DO (600 nm) de 0,2 aproximadamente igual a 1,0 x 10 8 UFC / ml. Por lo tanto, un DO (600 nm) de 0.7 es de unos 3,5 x 10 8 UFC / ml. Este algoritmo debe ser validado para cada cepa HiNT antes de la inoculación. </li><li> Los tejidos EpiAirway AIR-100 se cultivan en bandejas con una superficie de 0,6 cm 2 y una membrana de 0,4 micras. Los tejidos están compuestos de ~ 8.0 x 10 5 a ~ 1.0 x 10 6 &lt;/ Sup células&gt;. Por lo tanto, la inoculación de 1,0 x 10 7 UFC corresponde a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 - 12. Para inocular, enjuague cada inserción EpiAirway como en 3.1, a continuación, añadir 28 microlitros de la suspensión bacteriana preparada en 4,2 a la superficie apical de cada inserto EpiAirway en la cabina de bioseguridad. No vacunar a los MM basal. Volver cada plato a la incubadora. </li></ol> 5. La cuantificación del inóculo HiNT <ol><li> Preparar un tampón fosfato salino (PBS) con gelatina al 0,1% (PBS-G), autoclave para esterilizar. Etiqueta de estéril de 1,5 ml tubos Eppendorf con las diluciones 1:10 deseado basado en el diámetro exterior (600 nm) de la alícuota del inóculo y 900 microlitros de la PBS estéril-G en cada tubo. </li><li> Determinar el número de las placas de agar chocolate para enumerar los HiNT inoculados. Coloque estas placas en una incubadora de aire al revés con la parte inferior de la placa de descanso en la mitad de la parte superior de una hora. Esto permitirá que la placa de tanto calor a 37 ° C y la superficie se seque, lo que facilita el abandono de placas de NTHi. </li><li> Iniciar las diluciones seriadas 1:10 de la inoculación mediante la adición de 100 microlitros de la suspensión bacteriana de 4,2 al primer tubo. Vortex cada dilución vigorosamente por 5 segundos antes de hacer la siguiente. Caída de 10 microlitros alícuotas en las placas de agar previamente calentada y la superficie seca de chocolate, con la mitad del plato para cada dilución. Cinco o seis alícuotas de 10 microlitros puede caber en la mitad de cada placa de 100 mm, sin correr juntos. Al lugar seco y al revés en un 37 ° C humidificado incubadora de CO 2 durante la noche. </li><li> Al día siguiente, determinar las UFC / ml, contando las diluciones que tengan 15 a 30 colonias distintas en cada gota y calcular de nuevo a su actual inóculo viable de NTHi. </li></ol> 6. A largo plazo co-cultivo con NTHi <ol><li> Cada 24 horas, lavar los insertos como en 3.1, entonces la piscina del lavado de cada tejido que ha sido inoculados con la misma cepa de bacterias y se congelan a -20 ° C en un criovial etiquetados para su posterior análisis. Estas muestras pueden ser analizados para detectar la presencia de mucina por manchas de punto o de la expresión de citoquinas por ELISA. Por otra parte, los tejidos pueden ser cosechados para el mRNA y qPCR se puede realizar en los genes de interés. Cambiar el MM basal diaria como en 3.2. Continuará por la duración de la co-cultivo. </li></ol> 7. La recolección de los tejidos EpiAirway <ol><li> Prepare una solución fresca al 1% de saponina en D-PBS sin calcio y el magnesio, el filtro a esterilizar y calentar a 37 º C. </li><li> Calentar un tubo de 50 ml de MM y otro de D-PBS sin calcio y magnesio a 37 º C. </li><li> Preparar tubos de dilución, como en 5.1, así como un vacío estéril de 1,5 ml tubo Eppendorf por plaquita, marcado con el número de inserción y la tensión NTHi. </li><li> El EpiAirways pueden ser cosechados, ya sea total de células asociadas a las bacterias, que incluye tanto los organismos adherentes e interiorizado, o por bacterias internalizadas solamente. </li><li> Determinar el número de las placas de agar chocolate necesarios para colocar la placa de la célula asociada o invadido HiNT, etiqueta y seco durante una hora en una incubadora de aire como en 5.2. </li><li> Para la cosecha total de células asociadas a las bacterias, enjuague la superficie apical de la EpiAirways tres veces con 200 microlitros de D-PBS sin calcio ni magnesio, y luego la inclinación de la inserción y enjuagar cualquier resto de MM de la membrana basal. El primer lavado se pueden congelar para su posterior análisis; descartar los lavados siguientes. </li><li> Coloque el inserto de lavado en un fresco de 6 pocillos sin MM, y microlitros pipeta 250 de la solución estéril de 1% saponina de 7,1 en la superficie apical de cada tejido. Volver a la incubadora durante 10 minutos. </li><li> Retirar de la incubadora, y utilizando una aguja estéril P1000 punta de la pipeta, el matorral de los tejidos de la membrana con una devolución de adelante y hacia atrás, seguido por un movimiento circular para eliminar el tejido de los bordes de la pieza. El uso de un gran calibre punta de pipeta P1000, el lugar de la suspensión en el tubo de vacío etiquetados preparados de 7,3. Añadir 250 microlitros de D-PBS sin calcio o magnesio en la superficie apical de la inserción. </li><li> Examine la pieza utilizando un invertido de contraste de fase microscopio para determinar si hay algún resto de tejido para ser cosechado. Si es necesario, frote de nuevo con otra punta de la pipeta estéril P1000, a continuación, añadir esta suspensión al tubo de 7,8 con un gran calibre punta de pipeta P1000. Obtener un volumen total del tubo de 1 mililitro con D-PBS sin calcio ni magnesio. </li><li> Vigorosamente el vórtice de una suspensión celular a toda velocidad durante un minuto. Utilizando una jeringa estéril de 1 equipada con una aguja de calibre 26, aspirar la suspensión dentro de la jeringa por la aguja. Poco a poco pasar la suspensión a través de la aguja 3 veces, teniendo cuidado de no crear burbujas. Agitar vigorosamente de nuevo durante un minuto. </li><li> Con una punta de gran calibre pipeta, colocar 100 microlitros de la suspensión en el primer tubo de dilución preparada en 7.3. Agitar vigorosamente durante cinco segundos, a continuación, hacer diluciones seriadas 1:10. Placa de abandono de las diluciones que desee en las placas de agar seca en la superficie del chocolate. </li><li> Para cosechar las bacterias internalizado sólo, lavar cada inserción 3 veces con 200 microlitros de D-PBS sin calcio ni magnesio. Conservar y congelar el primer lavado. Añadir sulfato de gentamicina para pre-calentado MM a una concentración final de 100 microgramos / ml. Prepare 1,5 ml de los medios de comunicación por plaquita para ser cosechado. Vuelva a colocar el MM basal con la MM de gentamicina que contienen, y añadir 300 microlitros de gentamicina que contienen MM en la superficie apical. Colocar la placa en la incubadora de CO 2 durante una hora. </li><li> Retire la MM que contienen gentamicina de la superficie apical y lavar la superficie apical y la membrana basal de la inserción extensamente con pre-calentado D-PBS sin calcio y magnesio. Proceda como en 7.7-7.11. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Micrografías electrónicas de barrido de (A) del tejido y el tejido infectado EpiAirway (b) después de 5 días de co-cultivo con NTHi se muestra en la Figura 1. Largo plazo co-cultivo con NTHi no da como resultado un daño significativo a la apical tejidos, lo que subraya la utilidad del modelo de EpiAirway. Un gráfico que representa el número de bacterias internalizadas cuantificados en el tiempo dentro de los tejidos se muestra en la Figura 2. Ambos resultados son reproducibles, por lo que los tejidos EpiAirway una consistente y biológicamente relevantes en el modelo in vitro de las vías respiratorias superiores humanos para estudiar HiNT huésped-patógeno interacciones. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Microscopía electrónica de barrido de los tejidos EpiAirway. A. tejido de control no infectados. B. tejido tras cinco días de co-cultivo con NTHi. No hay un daño significativo a la superficie apical se observa en los tejidos infectados. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Número de HiNT interiorizado a través del tiempo durante EpiAirway co-cultivo. R2866 cepa se inoculó en aproximadamente 1,0 x 10 7 UFC / inserción (Día 0), entonces cosechados por bacterias internalizado en cada momento indicado. Las barras representan n = 3 repeticiones por lo menos en duplicado. Las barras de error son SD.

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	<li>Murphy, T. F., Apicella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae:+a+review+of+clinical+aspects,+surface+antigens,+and+the+human+immune+response+to+infection.">Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection.</a> Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).</li><li>Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+as+a+pathogen+in+children.">Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children.</a> Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).</li><li>Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontypeable+Haemophilus+influenzae+isolated+from+intractable+acute+otitis+media+internalized+into+cultured+human+epithelial+cells.">Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells.</a> Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).</li><li>Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+human+tracheal/bronchial+epithelial+cell+culture+and+bovine+nasal+respiratory+explants+for+nasal+drug+transport+studies.">Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies.</a> J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).</li><li>Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+Echinacea+in+a+3-D+tissue+model+of+human+airway+epithelium.">The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium.</a> Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).</li><li>Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+biomarkers+of+pulmonary+exposure+to+tobacco+smoke+components.">Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components.</a> Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).</li><li>Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cyclodextrins+on+the+complexation+and+nasal+permeation+of+melatonin.">Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin.</a> Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).</li><li>Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components:+nicotine,+cadmium,+formaldehyde+and+urethane.">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicology. 244, 66-76 (2008).</li><li>Fahy, J. V., Dickey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+mucus+function+and+dysfunction.">Airway mucus function and dysfunction.</a> N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).</li><li>Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposing+roles+of+PAK2+and+PAK4+in+synergistic+induction+of+MUC5AC+mucin+by+bacterium+NTHi.">Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi.</a> 359, 691-696 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Este método permite la investigación a largo plazo de las interacciones huésped-patógeno en un fondo biológicamente relevantes de primaria tejidos humanos respiratorias en la interfase aire-líquido. Aquí hemos utilizado HiNT como el organismo de la infección, pero la interacción de cualquier bacteria que no presenta citotoxicidad inaceptable con el tiempo se puede cuantificar con este método. El modelo EpiAirway también puede ser utilizado para el estudio de los virus, las drogas o productos químicos que afe...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Catálogo # </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> Saponina </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% en D-PBS sin calcio ni magnesio, filtro de esterilización </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco buffer fosfato salino con calcio y magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco buffer fosfato salino sin calcio ni magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway libre de antibióticos tejidos </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway libre de antibióticos medio de mantenimiento </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Suministrada con el juego </td></tr><tr><td> Tampón fosfato 10 veces más solución salina </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Diluir a 1X antes de su uso </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Añadir a una concentración final de 0,1% en PBS 1 X y autoclave </td></tr><tr><td> Difco GC Base Medio (agar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave de 36 g en 500 ml ddH2O y se enfría a 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL hemoglobina (agar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave de 10 g en 500 ml ddH2O, se enfría a 60 ° C y mezclar con la base medio por encima de GC </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX enriquecimiento (agar chocolate) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Se enfría la mezcla de la base media de GC y la hemoglobina a 55 ° C y agregar 10 ml de IsoVitaleX rehidratado y verter en placas de agar chocolate </td></tr><tr><td> Pinza de disección de punta fina, curvada </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> De auto-sellado bolsas de esterilización </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de gentamicina, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Agregar 10 microlitros / ml a MM EpiAirway para la matanza de gentamicina </td></tr></tbody></table>

use of the epiairway model for characterizing long-term host-pathogen interactions

Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) están adaptados a los humanos bacterias Gram-negativas que pueden causar infecciones recurrentes y crónicas de la mucosa respiratoria 1, 2. Para estudiar los mecanismos por los cuales estos organismos sobreviven en el interior de los tejidos y las vías respiratorias, un modelo en el que puede tener éxito a largo plazo co-cultivo de bacterias y células humanas llevadas a cabo es necesario. Usamos primaria tejidos humanos epitelio respiratorio elevado a la interfase aire-líquido, el modelo EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Estos no son inmortalizados, bien diferenciados, en 3 dimensiones los tejidos que contienen uniones estrechas, las células ciliadas y no ciliadas, células caliciformes que producen mucina, y retener la capacidad de producir citocinas en respuesta a la infección. Este biológicamente relevantes en el modelo in vitro de la vía aérea superior humano puede ser utilizado en un número de maneras, el objetivo general de este método es llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de tejidos EpiAirway con NTHi y cuantificar células asociadas a bacterias e internalizada a través del tiempo . Además, la producción de mucina y el perfil de citoquinas de las personas infectadas co-cultivos se puede determinar. Este enfoque mejora en los métodos existentes de que los protocolos actuales que utilizan muchos sumergidos monocapa o Transwell cultivos de células humanas, que no son capaces de soportar las infecciones bacterianas durante períodos prolongados 3. Por ejemplo, si un organismo se puede replicar en los medios de comunicación por encima, esto puede resultar en niveles inaceptables de la citotoxicidad y la pérdida de las células huésped, deteniendo el experimento. El modelo EpiAirway permite la caracterización de largo plazo huésped-patógeno interacciones. Además, dado que la fuente de la EpiAirway es humano normal traqueo-bronquial células en lugar de una línea inmortalizada, cada uno es una excelente representación de la actual tejido humano del tracto respiratorio superior, tanto en estructura como en función de cuatro. Para este método, los tejidos EpiAirway son destetados de compuestos anti-microbianos y anti-hongos durante 2 días antes de la entrega, y todos los procedimientos se realizan bajo condiciones libres de antibióticos. Esto requiere consideraciones especiales, ya que tanto las bacterias y los principales tejidos humanos se utilizan en la misma cabina de bioseguridad, y son co-cultivadas por períodos prolongados.

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Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Este método permite la caracterización de bacterias extendido co-cultivo con EpiAirways, principal tejido humano respiratorias epiteliales cultivadas en la interfase aire-líquido, un biológicamente relevantes<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo. El enfoque se puede utilizar con cualquier microbio que puede ser objeto de cooperación a largo plazo de la cultura.

Utilización del modelo de EpiAirway para la caracterización de largo plazo Interacciones Huésped-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.6K vistas.  Mercer University School of Medicine. Este método permite la caracterización de bacterias extendido co-cultivo con EpiAirways, principal tejido humano respiratorias epiteliales cultivadas en la interfase aire-líquido, un biológicamente relevantes In vitro Modelo. El enfoque se puede utilizar con cualquier microbio que puede ser objeto de cooperación a largo plazo de la cultura.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Investigación

Inmunología e Infección

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un enfoque comparativo para caracterizar el paisaje del Huésped-Patógeno interacciones proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Crónica a largo plazo<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infección de las vías respiratorias en los ratones

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

El uso de<em&gt; Flexneri Shigella</em&gt; Para estudiar las interacciones Autophagy Citoesqueleto

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

Largo Plazo intravital Multifotónica de imágenes de microscopía de células inmunitarias en sanos y enfermos de hígado utilizando ratones CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Evaluación de la eficacia y la toxicidad de los ARN del VIH-1 Orientación de la producción para uso en terapia génica o de drogas

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

Un modelo de ratón IL-8 transgénicamente transgéni-<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoreo a Largo Plazo de las Respuestas Inflamatorias

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

Seguimiento en Vivo a largo plazo de la dinámica de la célula inflamatoria dentro de pupas de Drosophila

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...