Nuestro protocolo para un ensayo de luciferasa transcrito in vitro basado en ARN ayuda a estudiar la regulación de la traducción en células infectadas por el virus de la viruela. Además, una longitud personalizada del Poly(A)liter permite estudiar sus efectos regulatorios en la traducción. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la regulación de la traducción por parte de elementos Cis como 5'UTR y 3'UTR en ARNm y amplio espectro de iniciación de traducción.
El ensayo de reportero de luciferasa transcrito in vitro puede adaptarse para incorporar modificaciones al límite máximo y otras modificaciones y utilizarse para probar el efecto en la traducción. Para empezar, diseñe imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para generar el amplicon PCR que contiene los siguientes elementos en 5'a 3'dirección:T7-Promoter, Poly(A)liter, Firefly Luciferase ORF en una cola Poly(A) conocida como T7_12A-Fluc, incluyen varios nucleótidos adicionales en imprimación delantera seguidos de T7-Promotor Poly(A)litro o secuencia deseada 5'UTR y aproximadamente 20 nucleótidos correspondientes al extremo 5 del ORF del gen reportero. Ajuste la longitud de la imprimación en función de la temperatura de fusión correspondiente al 5'final del ORF del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente en la imprimación es idéntica a la cadena de detección del gen.
A continuación, diseñe la imprimación inversa para incluir Poli(A)cola y aproximadamente 20 nucleótidos. Ajuste en función de la temperatura de fusión correspondiente al ORF del 3'end del gen reportero, asegurándose de que la región correspondiente de la imprimación sea idéntica a la cadena antisrés del gen y que haya un codón de parada en el marco antes de la cola Poly(A). Para el control interno, diseñe otro conjunto de imprimadores que contenga los siguientes elementos en 5'a 3'direction:T7-Promoter, una secuencia de codificación aleatoria de 5'UTR que contenga la secuencia Kozak, Renilla Luciferase ORF y Poly(A)tail, conocida como T7_Kozak-Rluc.
Para configurar la reacción, añada reactivos en el siguiente orden a un tubo de PCR: agua libre de DNase, 2X de ADN polimerasa de alta fidelidad, imprimaciones y secuencia confirmada de ADN de plantilla luciferasa. Después de un ciclo estándar de PCR de tres pasos para generar una plantilla de ADN, detecte el producto PCR ejecutando 5-10% de la reacción pcr en una electroforesis de gel DE TAE de 1% de agarosa junto con un estándar de peso molecular. Para determinar el tamaño del producto PCR, visualice el gel bajo un iluminador UV.
Después de determinar el tamaño correcto del producto PCR, purízalo utilizando un kit de purificación de PCR disponible comercialmente utilizando 100 microlitros de agua libre de nucleasas para eluir el ADN. Compruebe la concentración del ADN purificado utilizando un espectrofotómetro y guárdelo en menos 20 grados Celsius para su uso para la transcripción in vitro inmediatamente. Para sintetizar el ARN del producto PCR, añada los siguientes reactivos a un tubo de microcentrífuga: agua libre DNase-RNase, mezcla de búfer NTP, análogo de tapa, plantilla de producto PCR y mezcla de polimerasa T7-ARN del kit de transcripción in vitro.
Homogeneizar. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas y luego proceder a la purificación del ARN sintetizado utilizando un kit de purificación de ARN. Para comprobar el ARN purificado, caliente el ARN a 70 grados durante cinco minutos para extraer la estructura secundaria y ejecútelo con gel TBE de 1,5 agarosa.
A continuación, visualice el gel bajo un iluminador UV. Compruebe la concentración del ARN purificado utilizando un espectrofotómetro. Aliquot y almacenar a menos 80 grados Celsius.
Células HeLa de siembra en una placa de 24 pozos para lograr 80-90% de confluencia al día siguiente e incubar durante la noche en una incubadora a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono. Infectar las células de HeLa con el virus de la Vacuna a una multiplicidad de infección de cinco y mantener las células HeLa no infectadas para la comparación. Luego incubar la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 10 a 12 horas.
Después de las horas deseadas después de la infección, mezclar 480 nanogramos de secuencia 12A con Arndor de Firefly Luciferase y 20 nanogramos de secuencia Kozak con Arnm De Renilla Luciferase en un tubo de microcentrífuga. En otro tubo de microcentrífuga, añadir 1,1 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica. Añadir 55 microlitros de medios séricos reducidos a ambos tubos, mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
A continuación, añada 55 microlitros de reactivo de transfección lipídica catiónica que contenga medios séricos reducidos al tubo que contiene ARNm. Mezclar suavemente pero a fondo con una pipeta e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, retire el medio de cultivo celular de las células y agregue 400 microlitros de medio sérico reducido por pozo.
Una vez finalizada la incubación, añadir 100 microlitros de la gota de la mezcla sabia y uniformemente por pozo de la placa de 24 pozos. Cinco horas después de la co-transfección con 12A Fluc y Kozak Rluc mRNA, eliminar el medio sérico reducido de las células y lalyse las células mediante la adición de 150 microlitros 1X tampón de lisis del kit de ensayo Luciferase capaz de realizar dos ensayos de reportero. Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, raspe las células con goma y jeringa estéril y transfiera a un tubo de microcentrífuga.
Para los desechos de células de pellet, centrifugar el izado a 12.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 30 microlitros de sobrenadante por pozo de una placa de ensayo blanca de 96 pozos con paredes opacas con un fondo sólido. Utilice el kit de ensayo De Luciferase y un luminómetro lector de placas multimodo para medir la luminiscencia dual utilizando la función cinética como se describe en el manuscrito.
Después de exportar los datos de lectura de luminiscencia a un formato de archivo deseable, determine la tasa de traducción relativa de 12A Fluc mRNA en células HeLA no infectadas e infectadas por VACV dividiendo el valor Fluc por el valor Rluc de control interno. Este ensayo se utilizó para probar la eficiencia de traducción de un ARNm Fluc que contiene un 5'Poly(A)liter en células infectadas y infectadas por VACV. Tanto las células infectadas no infectadas como las células infectadas por VACV se cotrans infectaron con éxito con Fluc y Rluc mRNA.
La división de Fluc por Rluc normalizó la eficiencia de la transfección en la estabilidad del ARN en las células. 5'Poly(A)liter que contiene ARNm tiene una ventaja traslacional durante la infección por VACV en comparación con las células no infectadas. Esto no se debió a la eficiencia diferencial de la transfección o a la estabilidad del ARNm, ya que el nivel de ARN era similar en las células infectadas no infectadas e infectadas por VACV cinco horas después de la transfección de ARNm.
Tenga especial cuidado al diseñar imprimaciones, ya que esto puede afectar no sólo a la eficiencia de la reacción PCR, sino también a todos los procesos posteriores que requieren el ADN amplificado. Este método es un ensayo importante para probar rápidamente la regulación de traducción por elementos Cis. Si es posible, este método debe ser corroborado por otros experimentos complementarios.
Se deben tomar precauciones durante el uso del virus de Vaccinia y evitar la exposición a sustancias químicas como bromuro de etidio y fenol.
