Este protocolo se puede utilizar para examinar bibliotecas de ensayos lentivirales o retrovirales para identificar nuevos reguladores de factores de transcripción en células cancerosas. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, de rendimiento medio y económica, y que utiliza equipos y reactivos comúnmente accesibles para la mayoría de los investigadores. Para ampliar y purificar cada vector lentiviral de la biblioteca, primero agregue 1,3 mililitros de caldo de Luria complementados con 100 microgramos por mililitro de ampicilina a cada pozo de un pozo de 96 pozos de profundidad.
Inocular cada pozo con dos microlitros de caldo de glicerol para una incubación nocturna a 37 grados celsius y 225 revoluciones por minuto. Al día siguiente, transfiera cada cultivo de bacterias a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros para centrifugación. Purifique cada vector con un kit de miniprep bacteriano adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para cada vector de la biblioteca preparada, sembra un pozo de una placa de 24 pozos con una por 10 a la quinta célula 293FT e incuba las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Para preparar una mezcla de transfección que se configurará para cada vector en la biblioteca, primero ele cada vector lentiviral a una concentración final de 50 nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasas. Transfiera cinco microlitros de cada dilución a pozos individuales de una placa PCR de 96 pocillos.
Haga una supermezcla de transfección mezclando 1,25 microlitros veces x de reactivo de transfección uno con 23,75 microlitros veces x de tampón de transfección precalentado. Incubar la súper mezcla de transfección a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añadir 125 nanogramos por x de psPAX2 y 125 nanogramos por x de VSVG a la súper mezcla con pipeteo suave.
Inmediatamente aliquot la súper mezcla en cada tubo de una tira de PCR y utilizar una pipeta multicanal para transferir 25 microlitros de la mezcla en cada pozo de vector viral diluido. Después de una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente, utilice una pipeta multicanal para transferir 30 microlitros de cada mezcla de transfección de cada pozo a un pozo correspondiente de 293FT células en la placa de 24 pocillos previamente preparada. Incubar las células durante 24 horas antes de reemplazar el medio en cada pozo con 500 microlitros de medio de crecimiento completo fresco para otra incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular.
Al día siguiente, utilice una pipeta multicanal para recoger el sobrenadante viral de cada pozo y aliquot 220 microlitros de cada sobrenadante en dos pozos en una nueva placa de 96 pozos para generar una placa de sobrenadante viral. Para preparar las células A375 para la infección, se siembra una vez 10 a las quintas células en una placa de 24 pozos en 0,5 mililitros de medio de crecimiento completo por pozo para cada vector viral en la biblioteca. Incluya un pozo extra que no esté infectado para servir como control para la selección de drogas.
Después de una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular, descongele el sobrenadante lentiviral de matriz congelada establecido a temperatura ambiente antes de reemplazar el medio de crecimiento de cada pozo de la placa de cultivo celular preparada por 200 microlitros de medio de crecimiento complementados con 20 microgramos por mililitro de polibreno. Usando una pipeta multicanal, transfiera 200 microlitros de sobrenadantes virales de cada pozo de 96 a cada pozo de la placa de 24 pozos. Devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 a 48 horas.
Al final de la incubación, reemplace el medio en cada pozo por 500 microlitros de medio de crecimiento complementados con puromicina y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas adicionales. Después de la selección de puromicina de 48 horas, ordene las células en tres o cuatro grupos de modo que todos los pozos de un solo grupo tengan una densidad celular similar y agreguen 200 microlitros de trippsina-EDTA a un pozo representativo de cada grupo para una incubación de cinco minutos a 37 grados centígrados. Una vez que las células se han desprendido, neutralizar la tripina con 400 microlitros de medio de crecimiento complementados con puromicina y contar el número de células de cada pozo tripinsario.
Diluir cada suspensión celular a un dos veces 10 a la quinta concentración de células por mililitro con medio de crecimiento complementado con puromicina y semilla 500 microlitros de células de cada pozo en la misma posición de pozo en una nueva placa de 24 pozos. Después de usar los recuentos de cada pozo representativo para estimar el número de celda en cada pozo restante en cada grupo, agregue el volumen adecuado de trippsina-EDTA a cada pozo para lograr una concentración de una por 10 a las sextas células por mililitro. Durante la tripsinación, utilice una pipeta multicanal para añadir 400 microlitros de medio de crecimiento complementados con puromicina a los pozos correspondientes apropiados en la nueva placa de 24 pozos.
Una vez que las células se hayan desprendido, mezcle suavemente el contenido de cada pozo y transfiera 100 microlitros de cada suspensión celular al pozo correspondiente apropiado en la nueva placa de 24 pozos. Luego devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante 24 horas. Para transfecar las células con las construcciones del reportero de doble-luciferasa, prepare la mezcla de dilución de transfección como se indica en la tabla.
Para preparar la mezcla de dilución del reportero, mezcle los volúmenes de cada reactivo multiplicados por el número total de transfeccións más varios volúmenes adicionales. A continuación, mezcle la mezcla de dilución de transfección con la mezcla de dilución del reportero e incubar la solución resultante a temperatura ambiente durante 15 minutos para producir la mezcla de transfección. Durante la incubación, enjuague cada pocóculo de la placa de cultivo celular con 250 microlitros de PBS y agregue 447 microlitros de medio de crecimiento completo fresco a cada pocóyo.
A continuación, utilice una pipeta multicanal para distribuir 53 microlitros de mezcla de transfección a cada pocero de la placa de cultivo celular. Coloque la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Para medir la actividad de la luciferasa, diluir el tampón de lisis pasiva 5X del kit de actividad de la luciferasa en una dilución de uno a cinco con agua desionizada y descongelar los volúmenes necesarios de reactivo A y tampón de reactivo B del kit.
Cuando los reactivos estén listos, sustituya el sobrenadante de cada pozo por 75 microlitros de tampón de lysis pasiva e incubar la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación ocasional. Durante la incubación, diluya el sustrato del reactivo B 50X del kit a una concentración de uno a 50 con tampón de reactivo B descongelado. Al final de la incubación, agregue 30 microlitros de tampón de lysis pasiva a cuatro pozos de control en blanco y transfiera 30 microlitros de allicades de cada pozo a pozos duplicados de una placa de ensayo blanco de fondo plano de 96 pocillos.
Cuando todo el lisosato haya sido chapado, utilice una pipeta multicanal para añadir 50 microlitros de reactivo A a cada pozo y lea la señal luciferasa con un lector de placas. A continuación, utilice una pipeta multicanal para añadir 50 microlitros de reactivo B a cada pozo y lea la señal de Renilla luciferase con un lector de placas. Como era de esperar, YAP2SA aumenta la actividad de la luciferasa de la luciérnculo de fuego, pero no la actividad de la Luciferasa renilla en comparación con el vector de control.
Por el contrario, YAP2SA S94A no aumenta la actividad de la luciosa de luciélula. Es importante destacar que YAP2SA no altera la actividad de una construcción promotor mínima que carece de los elementos de enlace MCAT TEAD. En las células transfectadas con la construcción del reportero YAP-TAZ-TEAD, las horquillas cortas YAP y TAZ en tándem redujeron significativamente los niveles de luciferasa de luciélula de fuego, pero el control de la horquilla corta de control no lo hace.
Por el contrario, en las células transfectantes con la construcción mínima del reportero, el ARN de horquilla corta YAP-TAZ no altera significativamente los niveles de luciferasa de luciosa. La señal Renilla en cada pozo tampoco se ve alterada significativamente por el control corto de horquillas sin orientación o el ARN de horquilla corta YAP-TAZ. Como era de esperar, los ARN cortos dirigidos a YAP y TAZ, SARC o PI3 quinasa reducen significativamente la actividad de YAP-TAZ-TEAD.
Los ARN de horquilla corta dirigidos a ATM, CDH1, CSK, ERBB2 y gelsolina aumentaron los niveles normalizados de luciferasa de luciérnqueo de forma coherente con los estudios publicados que muestran que estas proteínas eran YAP y/o TAZ. A pesar de los roles establecidos para ATR, CCNE2 y ERBB4 en otros tipos de células, los ARN cortos dirigidos a estos genes no cambian significativamente los niveles normalizados de luciferasa de luciosa en las células A375. Después de esta pantalla, la identificación de los reguladores debe ser validada usando otras lecturas para su actividad de factor de transcripción.
También debe confirmarse la eliminación efectiva del regulador identificado por el ensayo. Recuerde tener cuidado y seguir las pautas de seguridad cuando trabaje con lentivirus infecciosos, especialmente si los virus son infecciosos humanos.
