Estamos muy agradecidos con el Dr. Xiaolian Gao, de la Universidad de Houston, para asesorar a la plataforma de microarrays LC Ciencias miRNA, el Dr. Karin Edvardsson, Instituto Karolinska, de Suecia, y el Dr. Eylem Aydogdu de la Universidad de Houston, por compartir sus conocimientos miRNA . Las investigaciones realizadas en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de la Salud con el número Premio R01CA172437. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Este trabajo también fue apoyado por subvenciones del Fondo de Tecnología Emergente de Texas, bajo el Acuerdo no. 300-9-1958.

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Trans. 40 (4), 752-758 (2012).</li><li>Kao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+profiling+of+breast+cancer+cell+lines+defines+relevant+tumor+models+and+provides+a+resource+for+cancer+gene+discovery.">Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery.</a> PLoS One. 4 (7), e6146 (2009).</li><li>Lacroix, M., Leclercq, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+breast+cancer+cell+lines+as+models+for+breast+tumours:+an+update.">Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update.</a> Breast Cancer Res. Treat. 83 (3), 249-289 (2004).</li><li>Ross, D. T., Perou, C. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Determinar el mecanismo de regulación hormonal de miRNA en células de cáncer de mama puede servir de plataforma para la comprensión de esta enfermedad y puede proporcionar un tratamiento potencial para el cáncer de mama. El cultivo de estas células para proporcionar la condición óptima para la acción de la hormona es muy importante. Aquí, un protocolo que se asegura de que se excluyó la hormona de interés (estrógeno) antes del tratamiento y de que se utilizó una dosis óptima de E2 durante un tiempo apropiado durante el tratamiento se ha descrito. Otros efectos de los factores hormonales y de crecimiento se mantuvieron a un mínimo mediante la reducción gradual de los niveles de suero y utilizando DCC-FBS, que es de FBS que se han despojado de la mayor parte de su hormona, citoquinas, y factores de crecimiento. El fenol medios de comunicación libre de rojo se utiliza, además, para reducir al mínimo otros efectos no hormonales, dado que el rojo de fenol se ha informado que tienen actividad estrogénica y afectar a ciertas funciones en líneas celulares 20,21. El tiempo de exposición de las células a la hormona es de gran importancia. Para la regulación de estrógenos asociada de los genes, se ha demostrado previamente que el 24-hrexposure producir respuesta significativa de los genes diana directos en las células de cáncer de mama 1,18. Desde miRNAs son transcritos por la ARN polimerasa II, como ARNm, es concebible que este es un punto de tiempo adecuado para detectar la regulación directa también de miRNAs. Es aún por determinar si y cómo estos miRNAs afectan a la expresión de estos objetivos ER conocidos en células de cáncer de mama. de perfiles de expresión de miARN puede ser un reto debido al pequeño tamaño relativo del miRNA, el hecho de que la secuencia de los genes miARN madura se puede encontrar también en el pri-miRNA y el pre-miRNA, y debido a la heterogeneidad en su contenido de GC 22. Varias técnicas de perfilado y químicas se han utilizado para superar esta dificultad. Entre ellas se encuentran los diferentes enfoques de microarray y análisis qPCR (Figura 2). Aunque microarrays es ampliamente aceptado para toda anal genomalisis, puede proporcionar falsos negativos y no existen diferencias entre las plataformas disponibles, que van desde la química a la tecnología de impresión 23. También el proceso de normalización constituye un reto en el análisis de los relativamente pocos genes miARN, que se cuentan en miles en comparación con las decenas de miles de transcripciones de ARNm. qPCR, por otra parte, es más sensible, y se aplica mejor cuando menos genes han de ser consideradas. Sin embargo, cuando se realiza en grandes placas de 384 pocillos, con una sola técnica de reproducir por placa, múltiples placas deben ser analizados para cada muestra de lo que hace el análisis costoso. Además, en nuestras manos, se obtuvieron resultados negativos más falsos utilizando el análisis de DLP-LDA en comparación con el microarray. Dado que la secuencia de los genes miARN maduro está presente en la pri-genes miARN y las secuencias de pre-miARN, es de interés para diferenciar entre estas transcripciones utilizando técnicas de PCR 24. Sondas DLP están disponibles también para pre-miRNAs, y specific cebadores también se pueden diseñar para excluir diferente maduro o precursor de colorante de cianina usando variantes de la tecnología de la qPCR. qPCR es un estándar de oro para la validación de la expresión diferencial de los perfiles de los resultados. La eficacia de la qPCR, sin embargo, depende de varios parámetros, incluyendo la extracción de RNA, la integridad del ARN (calidad), la síntesis de ADNc, el diseño del cebador, método de detección (química), y el gen de referencia para la normalización de datos 1,22,25. Las opciones para el diseño de cebadores para el análisis de miRNA es muy limitada, ya que la corta longitud de la secuencia de los genes miARN no da margen para mucho diseño alternativo de imprimación, y sólo un cebador pueden ser albergados en esta corta secuencia. Por lo tanto, la necesidad de manipulaciones alternativos como se ilustra en la Figura 2. Técnico repeticiones son importantes para validar la robustez del método de amplificación y el proceso empleado. Se requieren repeticiones biológicos para una representación de la Variatio biológica en generaln, incluyendo la respuesta variable para ligando tratamiento, y para demostrar que los efectos observados en una célula son reproducibles. Basándonos en nuestra experiencia, pueden ocurrir variaciones en la expresión de miRNA entre cultivos celulares. Por lo general, estas diferencias son menos de 1,3 veces, y el promedio de los valores y la correspondiente SD identifica la variación natural y tecnológico. Esta variación puede ser el resultado de diversos factores, entre ellos, la densidad celular y el hecho de que las funciones celulares podrían cambiar de paso a paso. Identificar expresiones estadísticamente significativos resultantes del tratamiento ligando, un significado ampliamente aceptado es cuando el valor de p es menor que 0.05. En este caso, se han utilizado la prueba t de un estudiante en los biológicos y técnicos repeticiones utilizando la distribución de dos colas y dos muestras parámetros de varianza desigual. Existen otros parámetros t-test, y la elección depende de la configuración experimental 26. Un protocolo detallado en la evaluación de las regulaciones hormonales de madura MIRNA en células de cáncer de mama se ha proporcionado. Tecnologías importantes y de la química en los perfiles y validación de estos miARN expresiones se han explicado con claridad. La tecnología elegida para el estudio de miRNA en células de cáncer de mama depende en última instancia de lo que exactamente se está investigando.

El estrógeno es una hormona que es importante durante el desarrollo de la glándula mamaria. El estrógeno también juega un papel importante en el desarrollo, el mantenimiento, el riesgo y el tratamiento del cáncer de mama 1. El estrógeno ejerce su función mediante la unión a las exigencias ambientales, que son factores de transcripción y regulan los genes diana específicos. De las dos variantes del receptor, ERα es esencial para la proliferación dependiente de estrógenos de células de cáncer de mama. La mayoría de los cánceres de mama son ERα-positivo y depende de los estrógenos para crecer. Esto ha hecho que la señalización de estrógenos y ERα un objetivo para el tratamiento en-receptor de la hormona del cáncer de mama positivo. Entender el mecanismo subyacente de ERα es importante para mejorar los resultados del tratamiento, vencer la resistencia al tratamiento, y entender cómo se desarrolla el cáncer de mama. miRNAs juegan un papel crítico en las funciones celulares, debido a su gran impacto en la post-transcripcional regulación de genes. miRNAs son 19-24 nucleótidos corta, de cadena sencilla, RNAs no codificantes que se transcriben primero por la ARN polimerasa II en transcripciones primarias miARN (pri-miARN). Ellos se procesan en el núcleo por Drosha en precursoras-miRNAs-horquilla corta (pre-miARN) y luego procesados ​​por Dicer y se separaron en cadenas sencillas para formar miRNAs maduros en el citoplasma. Los miRNAs maduros de una sola hebra se transfieren a las proteínas Argonaute para formar complejo RISC. Entonces, los miRNAs pueden hibridar con las regiones 3 &#39;no traducidas (3&#39;-UTR) de un ARNm diana, lo que lleva a la regulación post-transcripcional mediante el bloqueo de la traducción o degradar el ARNm diana 2. Debido al importante papel que tanto estrógeno como miRNAs juegan en la progresión tumoral, la identificación de miRNAs asociados con la señalización normal o alterado el estrógeno es importante con el fin de mejorar nuestra comprensión del desarrollo y mejorar el tratamiento del cáncer de mama. Si bien existe una buena comprensión de cómo ERα regula los genes codificadores de proteínas, la extensióny los detalles de los reglamentos de ARN no codificante queda por investigar a fondo. Los primeros estudios con el objetivo de aclarar la regulación ERα de miRNA en líneas celulares de cáncer de mama han arrojado resultados contradictorios, aún cuando la misma línea celular se ha analizado 3-6. Esto puede ser el resultado de tratamientos diferentes, variaciones biológicas, el uso de diferentes técnicas, y el hecho de que el pequeño tamaño de miRNAs los hacen difíciles de analizar. Aquí, un protocolo que controla las variaciones y artefactos método se describe. Para identificar qué miRNAs están reguladas por los estrógenos, el perfil de un modelo de cáncer de mama bien definido de la actividad ERα es un primer paso. Varias líneas de células han sido generados a partir de los tumores de cáncer de mama humano ERα-positivo, que son dependientes de los estrógenos similar a la mayoría de los cánceres de mama clínicos. Las propiedades moleculares de dos de estas líneas celulares, T47D y MCF7, incluyendo la expresión de ERα y su diana aguas abajo,el receptor de la hormona de progesterona (PR), una falta de expresión de receptor de membrana de HER2, junto con la expresión de los genes de diferenciación de estrógeno-sensibles y-luminales epiteliales, las hace adecuadas como modelos para el subtipo luminal de los tumores de mama 7-10. 17β-estradiol (E2) es la forma dominante de estrógeno, y las concentraciones y puntos de tiempo para la activación transcripcional óptima de ERα se han caracterizado en múltiples estudios. En este protocolo de tratamiento 10 nM E2 durante 24 horas se usa y T47D y MCF7 como modelos para la actividad ERα en células de cáncer de mama 1. Además, las regulaciones miARN dependientes del tiempo se pueden analizar específicamente en un intervalo de tiempo de, por ejemplo 1-72 horas. En segundo lugar, el análisis de miRNA tiene retos diferentes, en parte debido a sus tamaños cortos. miRNAs no están bien conservados en la preparación de ARN total cuando se realizan guanidinio thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitaciones regulares de ARN, o cuando erse utilizan purificaciones de columna Andard. Precauciones especiales deben tomarse para mantener o enriquecer la fracción más pequeña de ARN. Al aumentar el volumen de isopropanol, disminuyendo la temperatura antes de la centrifugación (-80 ° C), y omitiendo el lavado en etanol al 70%, la retención de miRNAs se puede mejorar durante la precipitación. O, columnas y tampones específicos para una preparación de alta calidad y robusto de ARN total que contiene los genes miARN-pueden ser utilizados. También para el análisis en sí, sus tamaños cortos crean retos. Para el cribado miRNA de todo el genoma, hay tres miRNA comunes técnicas de perfiles para elegir: microarrays, qPCR, y la secuenciación de próxima generación. Cada técnica se puede realizar utilizando varias plataformas diferentes, y se requieren diferentes preparaciones de muestras, cada una con diferentes riesgos de introducción de artefactos. En miARN microarrays, una diapositiva es descubierto o sintetizado con miles de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos se utilizan como sondas, y cada uno de la sondas está diseñado para hibridar con una secuencia de los genes miARN en particular. La preparación de la muestra para microarrays, como se realizó en este estudio, primero enriquece para miRNAs y luego introduce el etiquetado Cy5 y Cy3 en los miRNAs. Microarray da la oportunidad de observar los niveles relativos de expresión de un gran número de genes simultáneamente, es rápido y adecuado para el cribado de gran número de muestras, pero sólo puede analizar las secuencias presentes en el microarray y por ejemplo no detectar cambios en la desconocida o mutado miRNAs. Análisis de microarrays como se realizó en este protocolo también requiere cantidades relativamente grandes, de aproximadamente 5 microgramos, de ARN total por muestra para el análisis. De baja densidad qPCR miARN perfiles requiere menos material (700 ng / muestra y replicar), y permite la detección y cuantificación de miRNAs. Los niveles de transcripción pueden ser determinados, y la cantidad puede ser una cantidad absoluta o una cantidad relativa. análisis qPCR requiere en primer lugar la conversión de miRNA en cDNA, aquí mediante el uso de un buclecartilla para cada miARN específicas que garanticen el análisis de sólo madurar miRNA. Esto genera una plantilla ya que puede amplificarse utilizando un cebador directo-miARN específica y un cebador inverso universal, complementaria a la secuencia de bucle, y puede albergar la inclusión de una sonda de doble etiquetado para la especificidad. qPCR se puede utilizar en un formato de baja densidad donde cientos de miRNAs se pueden detectar en paralelo usando una o varias placas de 384 pocillos con pares de cebadores individuales en cada pocillo 11. Secuenciación de próxima generación, en cambio, es la única de estas técnicas que permiten el descubrimiento de la novela, miRNAs mutados o editados, ya que todos los ARN en una muestra pueden ser secuenciados 11. Esta técnica, sin embargo, requiere de múltiples medidas para enriquecer ARN pequeños y producir una pequeña biblioteca de ARN mediante varios pasos de la ligadura de enlazador y purificaciones con posteriores mejorados riesgos de la modulación de los niveles de expresión relativa entre las muestras. También requiere bioinformati significativasanálisis cs. Dadas las diversas técnicas para miARN perfiles, la técnica más apropiada depende de las aplicaciones. Microarrays son los más adecuados cuando el material es relativamente abundante y el interés es definir la expresión diferencial de miRNAs ya conocidos. De baja densidad matrices qPCR son los más adecuados cuando una cantidad limitada de muestra está disponible y se requiere una alta sensibilidad de miRNAs bajos expresó. La secuenciación es más adecuado cuando se requiere el análisis de miRNAs desconocidos, mutado o diferentes isoformas de un miARN. En el estudio de miRNAs regulados por estrógenos en el cáncer de mama, se utilizan dos líneas de células modelo, T47D y MCF7, donde grandes cantidades de ARN están fácilmente disponibles. Cada línea celular se analizó en cultivos de células replicadas utilizando diferentes pasajes, cada uno en repeticiones técnica de tratamiento. Esto permite la detección robusta de reproducible, miRNAs regulados ERα. Los niveles relativos de expresión de miARN se compararon utilizando tanto miARN microarrays yLas sondas marcadas dobles - arrays de baja densidad (DLP-LDA) y validaron los resultados con la PCR cuantitativa utilizando tanto tinte Cyanine y químicas DLP. reglamentos miARN fueron analizadas más en el tiempo de la serie para definir su regulación exacta con el tiempo, lo que puede ayudar a diferenciar las variaciones aleatorias o circadianos de las regulaciones inducidos por estrógeno, e indicar los efectos primarios de los efectos secundarios. Comparaciones bioinformatical con estudios de unión a la cromatina de ERα pueden ayudar aún más en la diferenciación de primaria frente a los efectos secundarios. El ensayo dio lugar a una evaluación fiable de la normativa miARN donde se podría establecer que, después de tratamiento E2 24 hr codificación de proteínas transcripciones fueron reguladas fácilmente pero miRNAs maduros no fueron afectados 1. Sin embargo, es posible que los miRNAs están regulados en los puntos de tiempo posteriores, como se demuestra en el análisis de series de tiempo de miRNAs seleccionados 1. Los detalles deben estudiarse más a fondo y el protocolo presentado aquí proporciona una robust manera de estudiar la regulación hormonal de miRNAs maduros en líneas celulares de cáncer de mama.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

El estrógeno juega un papel vital en el desarrollo de la glándula mamaria y la progresión del cáncer de mama. Es media su función mediante la unión a y la activación de los receptores de estrógenos (RE), ERα, y ERß. ERα es upregulated frecuencia en el cáncer de mama y las unidades de la proliferación de células de cáncer de mama. Las exigencias ambientales funcionan como factores de transcripción y regulan la expresión génica. Mientras la regulación de ERα de genes codificadores de proteínas está bien establecida, la regulación de las no codificantes microARN (miARN) es menos explorado. miRNAs juegan un papel importante en la regulación post-transcripcional de genes, la inhibición de su traducción o degradación de su ARNm. miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales y también son prometedores biomarcadores. Entre los ensayos de los genes miARN disponibles, microarrays y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han utilizado ampliamente para detectar y cuantificar los niveles de los genes miARN. Para identificar miRNAs regulados por la señalización de los estrógenos en el cáncer de mama, thexpresión eir en líneas celulares de cáncer de mama ERα-positivos se compararon antes y después de los estrógenos-activación utilizando tanto los microarrays μParaflo-microfluidos y doble etiquetado sondas arrays de baja densidad. Los resultados fueron validados utilizando qPCR ensayos específicos, aplicando tanto tinte basado Cyanine y doble etiquetado química basada en sondas. Además, se utilizó un ensayo de punto de tiempo para identificar las regulaciones a través del tiempo. Ventajas de la utilización del ensayo miRNA utilizado en este estudio es que permite una detección rápida de los reglamentos madura miARN en numerosas muestras, incluso con cantidades de muestra limitados. La disposición, incluidas las condiciones específicas para el cultivo de células y el tratamiento con estrógenos, biológicos y técnicos repeticiones, y el cribado a gran escala seguida por confirmaciones en profundidad el uso de técnicas diferentes, garantiza una detección robusta de las regulaciones miARN, y elimina los falsos positivos y otros artefactos. Sin embargo, los miRNAs mutados o desconocidos, o regulaciones de la leve transcrito primario y precursorl, no será detectado. El método presentado aquí representa una investigación a fondo de la regulación de los genes miARN mediada por estrógenos.

Una visión general de este enfoque se presenta en la Figura 1 y una comparación de las diversas preparaciones de muestras y modificaciones de ácido nucleico requeridos para cada técnica se visualiza en la Figura 2. La condición y el medio ambiente de las células antes del tratamiento con una hormona es importante para determinar los efectos reales de la hormona 16. Algunos medio y suero contienen factores de crecimiento que pueden afectar a los resultados, por lo que las células son suero de hambre para asegurar que todos los efectos hormonales se han reducido a un mínimo. Por lo tanto, cuando el tratamiento con E2, hay más certeza de que los efectos observados están asociados-E2. Un factor importante es la confluencia de las células, lo que influye en contacto célula-célula y comportamientos tales como la señalización célula-célula y proliferación. Las células se dejaron a ser 80% confluentes (Figura 3A) y bien unidos para permitir el crecimiento y evitar la pérdida de células durante el posterior lavado y medios de comunicación CHange. Las condiciones durante la extracción y almacenamiento de ARN son importantes para la calidad del ARN y el análisis posterior. También se sabe que el número de células, el método de extracción, y el contenido de GC de los genes miARN pueden afectar el rendimiento y la calidad de ambos mRNAs y miRNAs 17. Por lo tanto, es necesario para llevar a cabo la extracción de ARN durante las condiciones de RNasa-libres y para comprobar la calidad del ARN antes de proceder con los experimentos. Después de la extracción, la cuantificación del ARN proporciona información sobre la concentración del ARN total (que contiene tanto los mRNAs y miRNAs), que permite la observación de rendimiento. También proporciona una representación gráfica de los resultados como se ve en la Figura 3B, y esto permite la observación de la pureza de la muestra (por lo general indicada por un pico, panel superior). Malo rendimiento de ARN no produciría ningún específica de absorción a 260 nm (Figura 3B, panel inferior). Para determinar si el ARN es de alta calidad, el ARNSe midió la integridad. Un número de la integridad del ARN (RIN) de entre 9-10 garantiza que el ARN no se degrada y es de calidad óptima. Además, se debe observar la representación gráfica de la ARN, y el 18S y 28S rRNA debe tener picos, como se muestra en la Figura 4 (panel central). Comparación con la escalera (Figura 4, panel superior) identifica el tamaño de los picos. Un ARN degradado tendría picos menos claros y una cantidad relativa reducida de la 18S y 28S rRNA (Figura 4, panel inferior). La fracción de los pequeños RNAs más se puede asegurar mediante el Small RNA Kit Agilent. Se recomienda para validar la respuesta de estrógeno después del tratamiento, en las condiciones experimentales especificadas, antes de proceder a la detección de los genes miARN. Un qPCR se puede realizar en un gen diana ER conocida como PS2 o SPINK4 18, utilizando la plantilla de ADNc. Estos genes están regulados por incremento general en 1-24 horas después del tratamiento E2. Una vez que la calidad del ARN y la respuesta de estrógenoha sido evaluado, más experimento puede llevarse a cabo. Microarray es todavía una técnica ampliamente utilizada para el cribado a gran escala para la expresión de los genes miARN en las células. Por ejemplo, los microarrays miARN vez usado contenía 894 miRNAs maduros y 50 controles sondas únicos en cuatrillizos 1. Las hibridaciones se realizaron en los duplicados con procedimiento de tinte de intercambio. Los resultados de microarrays miARN son generalmente gráficamente representados por mapas de calor. Figura 5A muestra un mapa de calor, que representa los datos de un miARN microarrays comparación entre el vehículo y las muestras tratadas E2. El color rojo indica que el miRNA es aumentada en la muestra tratada con E2 (mayor expresión), mientras que el verde indica regulación a la baja de los genes miARN (menor expresión). La selección de los genes miARN por lo general depende de su importancia en la expresión, y por lo general un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo. Los miRNAs que se indican que se expresó diferencialmente deben ser validados más with qPCR, para distinguirlos de los falsos positivos. La matriz DLP-LDA, por otra parte, utiliza un método basado en PCR cuantitativa para detectar miRNAs reguladas en un formato de 384 pocillos. Por lo general, dos placas de 384 pocillos (tarjetas) se proporcionan, piscinas A y B. Grupo A por lo general contiene una mejor caracterizado y más altamente expresado miRNAs que la piscina B. El nivel relativo de cada miRNA son determinados por qPCR, donde se analiza un miRNA por así (Figura 5B). Un mayor valor Ct indica menor expresión de miARN. Al igual que los microarrays miARN, los resultados obtenidos desde el DLP-LDA deben ser validados más para asegurar la exactitud. Validaciones se pueden realizar utilizando qPCR. Aquí, dos métodos de detección de qPCR se describen para evitar sesgo del método y para permitir la confirmación exhaustiva investigación y de regulaciones de los genes miARN. El Cyanine base de tinte química de detección funciona diferente que DLP porque el perfilado DLP-LDA se basa en, y es adecuado para confirmarfines ación. Puede ser menos específico, ya que detecta todo el ADN de doble hebra amplificado, pero la homogeneidad de la muestra se puede evaluar mediante la realización de un análisis de fusión de la curva. Figura 6A (panel izquierdo) muestra el análisis de fusión de la curva de un miARN, y un pico uniforme claramente definido puede ser visto. Se observaron múltiples picos de si el cebador es no específicos o cantidades significativas de cebador-dímero se forma (Figura 6A, panel derecho). Ensayos DLP miARN, por otro lado, es más específico, ya que sólo la amplificación de la diana se detecta miRNA. Gráficas de amplificación de cada uno de los genes miARN objetivo se pueden observar, como se ejemplifica en la Figura 6B. La opción para el control de la aparición de múltiples productos de amplificación utilizando el análisis de curva de fusión es, sin embargo, no está disponible con esta química y colorante de cianina qPCR es menos costoso. Ensayos de tinte de cianina y DLP qPCR veces pueden generado resultados ligeramente diferentes. Para ambos ensayos de qPCR, comparación con un refeSe requiere gen rencia para determinar la expresión relativa de los genes entre dos muestras. El gen de referencia, también conocido como gen de mantenimiento, debe ser un gen cuya expresión no se cambia y que se expresa en niveles similares como el gen de interés. Un ejemplo de un gen de referencia adecuado en estas líneas celulares de cáncer de mama es ARHGDIA, un inhibidor de la disociación de GDP-Rho que funciona reacciones de intercambio de GDP / GTP de las proteínas Rho. Como se observa en la Figura 6C (parte superior), el nivel de mRNA de ARHGDIA no se cambia entre el vehículo y las muestras de ligando-tratada. El 18S rRNA también se puede utilizar, aunque su alta expresión requiere una dilución 1:500 separada de la población de ADNc y por lo tanto es menos adecuado. Para el análisis de miRNA, todavía hay un debate sobre un gen de referencia bien definido. Hasta ahora, la U6 snRNA es un gen de referencia que es ampliamente aceptada para el análisis de miRNA. U6 snRNA es el ~ 110 nucleótidos de largo no codificante ARN pequeño, nuclear que funciona en nuclear pre-mRNA splla formación de hielo 19. Como se observa en la Figura 6C (abajo), los niveles de expresión U6 son aproximadamente los mismos en todas las muestras que se muestran, lo que permite el cálculo de los diferentes niveles de miRNA. Una representación gráfica de un resultado miARN qPCR para una comparación entre el vehículo y las células tratadas con E2 que se han normalizado a la U6 de referencia se puede observar en la Figura 6D. Esto ilustra un miRNA que se detectaron como no reguladas después del tratamiento E2 24 horas, pero que alberga sitios de unión a la cromatina-ER cercanas a su localización genómica y análisis de series temporales identificada regulación significativa de 72 horas después del tratamiento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figura 1. Una visión general del método empleado para la detección de la regulación hormonal de miRNA en células de cáncer de mama. </strong&gt; Proceso se inicia con la cultura y el tratamiento de células, seguido de gran escala de perfiles de miARN para identificar miRNAs expresadas diferencialmente posiblemente, y termina con validaciones QRT-PCR de resultados de la matriz. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figura 2. Comparación de las diversas preparaciones de muestras y manipulaciones de ácido nucleico para cada técnica de detección de los genes miARN. (A) miARN microarray utilizando el método de la tecnología μParaflo incluye el enriquecimiento, la poli-A de relaves y el etiquetado de ligación. (B) la preparación de muestras de tecnología DLP y método de detección incluye un cDNA síntesis del cebador en bucle que se extiende después de la etapa de desnaturalización y proporciona un fragmento más largo que alberga el preparación de la muestra cebador inverso y la secuencia de la sonda. (C) la tecnología de tinte Cyaniney el método de detección incluye poli A-colas, y la síntesis de ADNc con cebadores oligo-dT, incluyendo una secuencia universal de 5. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figura 3. Cultivo de células y la extracción de RNA. (A) Las células cultivadas a 80% de confluencia ilustran necesaria antes del tratamiento con ligando. (B) Representación gráfica de la concentración de ARN y la pureza después de la extracción. Cada pico representa una muestra y un proceso de extracción con éxito produce ARN puro (panel superior). Un ARN extraído mal muestra ningún pico de absorción a 260 nm clara (panel inferior). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figura 4. &amp; #160, el control de la calidad del ARN Los resultados de análisis de integridad ARN que muestra la representación gráfica de la escalera (arriba), un ARN de buena calidad (en el centro) y una muestra de ARN degradado (abajo).. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figura 5. Una ilustración de miARN perfiles de resultados. (A) Un mapa de calor representación de miARN microarrays resultados para miRNAs expresados ​​diferencialmente. miR-A, B, C son upregulated en la muestra tratada E2 como se indica en rojo, mientras que el miR-D, E, F, G se downregulated en la muestra tratada con E2 como se indica en verde. (B) gráficas de amplificación para cada uno miRNA de los resultados DLP-LDA. miARN detectado se amplifican como se indica por el aumento en el valor Rn. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. qPCR análisis de las regulaciones del miRNA. (A) Análisis de fusión de la curva para un miRNA analizados usando la detección de tinte Cyanine, mostrando homogeneidad de todas las muestras analizadas (izquierda) y la amplificación de múltiples fragmentos (derecha). (B) parcelas de amplificación para cada muestra para un miRNA. Esto puede ser de tinte de cianina o DLP métodos de detección. (C) Representación gráfica de barras de genes de referencia adecuados para el análisis de ARNm ARHGDIA (arriba) y para el análisis de miRNA U6 snRNA (abajo), que no muestran expresión diferencial significativa entre las muestras. (D) resultados miRNA qPCR para ilustrar la comparación de los niveles de expresión relativa de miR-135a durante un transcurso de tiempo. Figura 6D es reimpreso de Katchy et al. 1, con permiso de Elsevier. Los valores son por lo general el promedio de exper separadaiments (duplicados biológicos) ± SD. La prueba t de Student se utiliza para demostrar la significación: * p &lt;0,05.

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Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

profiling-of-estrogen-regulated-micrornas-in-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

19.9K vistas.  University of Houston.  Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala. 