Pour accéder aux interactions cibles neuronales de microARN avec les fonctions microARN est essentiel pour comprendre comment les MicroARN régulent divers processus biologiques dans les états sains et maladie. Ce protocole décrit la reproduction par stratégie visant à identifier les cibles de microARN et les microARN fonctionnels, car la validation de la cible directe des microARN est difficile. Notre protocole peut fournir un aperçu de la fonction des microARN individuels et de l’implication d’un microARN dans la thérapie contre le cancer.
Le calcul de la concentration inhibitrice semi-maximale est une méthode importante, non seulement pour les études de microARN, mais aussi pour l’évaluation efficace d’autres médicaments anticancéreux. Notre protocole sera utile aux nouveaux chercheurs puisque nous avons décrit la méthode fondamentale pour comprendre le niveau de microARN dans une cellule. Pour commencer le protocole, comptez les cellules avec le compteur cellulaire.
Plaquez les cellules dans une plaque de puits de 96. Le lendemain, préparez un ensemble de mélanges de transfection pour transfecter les cellules dans plusieurs concentrations finales de contrôle de microARN imiter, et microARN-107 imiter. À partir d’un stock de 25 micromolaires microARN contrôle imiter, ou microARN-107 imiter, diluer et ajouter le contrôle imiter ou microARN-107 imiter dans le média sérique réduit avec le réagent transfection dans les tubes de microcentrifugeuse.
Mélanger délicatement les mélanges contenant de l’oligo à l’aide d’une micropipette. Après une incubation de 10 minutes dans le capot de culture cellulaire, mélanger délicatement les mélanges contenant de l’oligo à nouveau, puis ajouter 50 microlitres des mélanges dans chaque puits. Gardez les cellules transfectées dans un incubateur de culture cellulaire.
Aspirez soigneusement le média de culture cellulaire dans chaque puits de la plaque et remplissez rapidement 100 microlitres d’acide trichloroacetic de 10%, ou TCA, dans chaque puits. Gardez la plaque contenant 10% de TCA à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, lavez la plaque plusieurs fois en la arrosant dans une baignoire avec de l’eau du robinet.
Retirer l’excès d’eau de l’intérieur des puits en tapant sur la plaque jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’eau et sécher la plaque. Pipette 50 microlitres de solution SRB de 0,4 % dans chaque puits, y compris les puits vierges. Secouez doucement la plaque jusqu’à ce que la solution 0,4 % SRB recouvre uniformément le fond des puits.
Ensuite, incuber la plaque pendant 40 à 60 minutes. Après l’incubation, laver la plaque avec 1% d’acide acétique jusqu’à ce que le colorant non lié soit totalement emporté. Pipette 100 microlitres de solution de base Tris de 10 millimolaires dans les puits correspondants, y compris les puits vierges.
Garder l’assiette sur un shaker pendant 10 minutes. Mesurer l’absorption à 492 nanomètres. Calculer le pourcentage d’absorption moyenne et l’écart type de chaque groupe à l’aide des valeurs d’absorption de l’analyse SRB.
Importer les données brutes, y compris les concentrations de traitement, l’absorption moyenne et l’écart type dans le logiciel en alignant verticalement les données. Cliquez sur l’onglet Créer un graphique et choisissez les barres d’erreur scatter simples. Sélectionnez les colonnes de feuille de travail sous forme de valeurs de symbole et cliquez ensuite.
Dans le panneau Format de données, sélectionnez paires X-Y et cliquez ensuite. Sélectionnez les colonnes de données correspondantes dans le panneau Sélectionner les données. Cliquez sur la finition pour créer l’intrigue.
Double-cliquez sur l’axe X pour modifier le type d’échelle dans l’échelle de l’axe. Modifiez le type d’échelle du linéaire au journal. Modifiez le numéro de plage de début et de fin à 0,01 et 200, respectivement.
Cliquez à droite sur n’importe quelle parcelle scatter, choisissez Curve Fit et rendez-vous à la sous-catégorie Utilisateur Défini. Sélectionnez la courbe de réponse à la dose. Cliquez sur les boutons suivant, puis cliquez sur terminer.
Allez à l’onglet rapport, puis vérifiez les valeurs n, k et R. Exécutez le PCR tel que détaillé dans le protocole texte qui l’accompagne. Passez ensuite à la double digestion en combinant les mélanges de réaction, y compris les enzymes de restriction Exo1 et Not1 dans un tube.
Incuber les mélanges pendant trois à quatre heures dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Exécutez les produits à double digestion sur un gel agarose de 1 %. Ensuite, coupez les bandes sous la lumière UV.
Purifiez les produits PCR à double digestion et les vecteurs de luciferase des bandes excisées. Continuer avec la ligature des produits PCR dans les vecteurs de luciferase en préparant 20 microlitres de mélanges de réaction de ligature, y compris la ligase d’ADN. Centrifuger brièvement le tube pendant 10 à 15 secondes.
Incuber la ligature à 16 degrés Celsius pendant la nuit à l’aide d’un cycleur thermique. Le lendemain, effectuer la transformation en ajoutant les mélanges de ligature dans le tube contenant des cellules compétentes. Appuyez doucement sur le tube et gardez-le sur la glace pendant 20 minutes.
Transférer rapidement et doucement le tube dans un bloc thermique à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes à une minute. Après le choc thermique, placer le tube sur la glace pendant 20 minutes. Étendre les cellules compétentes sur une plaque d’agar LB.
Cultiver des cellules compétentes dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, choisissez une colonie individuelle et réutilisez E.coli dans l’un des tubes à huit bandes contenant de l’eau ultrapure, et répétez cette étape pour résuspendre E.coli de quatre à huit colonies choisies au hasard. Transférer 25 microlitres de suspension E.coli dans un autre ensemble de tubes à 8 bandes.
Effectuez le PCR de la colonie à l’aide de la suspension E.coli. Préparer l’essai de luciferase dans une assiette de 24 puits. Ajouter une à deux fois dix aux quatre cellules dans un média de culture cellulaire de 500 microlitres pour chaque puits.
Après l’incubation pendant la nuit, transfect 50 nanogrammes de vecteurs de luciferase dans les cellules avec imitation de contrôle ou un microARN spécifique imiter à l’aide d’un réaccente de transfection. Le lendemain, lavez l’intérieur des puits deux fois à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate. Appliquer 200 microlitres de réagenisseur de lyse dans les puits et effectuer suffisamment de lyse cellulaire avant de mesurer l’activité de la luciferase.
Garder la plaque en secouant pendant au moins 15 minutes. Transférer de cinq à 10 microlitres de lysate cellulaire dans le nouveau tube, et ajouter 100 microlitres de réaccent et mélanger immédiatement la solution par pipetting. Ensuite, lisez l’activité luciferase firefly à l’aide d’illuminomètre pendant 10 à 15 secondes.
Ajouter 100 microlitres de réaccente deux dans le même tube, puis mélanger par pipetting deux fois. Enfin, lisez l’activité renilla luciferase pendant 10 à 15 secondes à l’aide d’un illuminomètre. RTPCR montre une réduction significative des cellules microARN-107 et PANC-1 et CAPAN-1 par rapport aux cellules HPNE.
Les niveaux de microARN-301 ont été significativement augmentés dans les cellules PANC-1 et CAPAN-1, comparées aux cellules HPNE. L’analyse de SRB dans cette étude démontre clairement que la prolifération des cellules PANC-1 a diminué suivant une transfection d’imitation de microRNA-107. Le criblage de 11 cibles potentielles prévues du microARN-107 montre clairement que seulement le gamma de synucléine, ou SNCG, un régulateur positif de la croissance de cellules de tumeur interagit directement avec des cellules de microARN-107 et de PANC-1, indiquant que le microARN-107 peut régler négativement la prolifération des cellules PANC-1 en modulant l’expression de SNCG.
Les analyses de prolifération cellulaire pour adultes qui utilisent l’entité à base d’hydroléum tetra et le CFSE sont applicables pour filtrer l’effet de tels que les imitations de microARN, selon les types de cellules. Sur la base de la fonction validée expérimentalement des microARN, un examen systématique de la base de données et du programme de prévision cible est nécessaire pour affiner la liste des cibles des candidats avant les essais de luciferase. Pour l’évaluation de l’efficacité combinée des microARN avec des médicaments anticancéreux, il est avantageux de calculer les valeurs ic ajustées en fonction de notre protocole pour l’évaluation de l’indice combiné.
