Los macrófagos asociados al tumor desempeñan un papel importante en el microambiente tumoral. Comprender cómo las diferentes mutaciones genéticas en las células tumorales afectan el reclutamiento de macrófagos es fundamental para diseñar un tratamiento personalizado para pacientes con cáncer. Este ensayo proporciona una manera fácil y robusta de evaluar la interacción entre las células tumorales y los macrófagos in vitro.
Este ensayo se puede modificar para evaluar las interacciones entre las células tumorales y otras células inmunitarias in vitro. Para comenzar este procedimiento, calienta el medio de células madre sin suero colocándolo en un baño de agua a 37 grados Centígrados durante 20 minutos. Rocíe la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie la superficie pulverizada con toallas de papel.
A continuación rocía las botellas de solución de desprendimiento de medio y celda con 70% de etanol y límpialas con toallas de papel. Transfiera las botellas limpias a la capucha de cultivo de tejido. Recuperar la célula tumoral y transferirla a la capucha de cultivo de tejido.
Aspirar el medio y lavar las células con 10 mililitros de PBS. A continuación, agregue dos mililitros de solución de desprendimiento de células al matraz. Ponga el matraz en la capucha, revisando cada minuto para ver si las células tumorales se han redondeado hacia arriba.
Una vez que las células tumorales se redondeen, toque suavemente el lado del matraz para ayudar a que las células se desprendan. Después de esto, pipetea ocho mililitros de medio celular libre de suero en el matraz y pipeta arriba y abajo tres veces para mezclar. Transfiera esta suspensión celular a un tubo centrífugo de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Aspirar al sobrenadante. Luego lave las células en 10 mililitros de PBS, asegurándose de pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para mezclar. Centrifugar las células a 200 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 mililitros de medio libre de suero. Pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces para mezclar. Mezclar 10 microlitros de esta suspensión celular con 10 microlitros de solución Trypan Blue.
Siguiente pipeta 10 microlitros de la mezcla Trypan Blue y celda en un portaobjetos, y utilice un contador de celdas automático para cuantificar el número de celda vivo. Utilice un medio celular libre de suero para ajustar la densidad celular a 2,5 veces 10 a las quintas células por mililitro. Luego sembrar dos mililitros de las células en cada pozo de una placa de cultivo de seis pozos.
Al mismo tiempo, preparar seis pozos con sólo dos mililitros de medio de células madre libres de suero. Después de esto, incubar las placas de seis pozos a 37 grados celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Primero rocía la superficie de la campana de cultivo de tejido con 70%etanol y limpia la superficie pulverizada con toallas de papel.
A continuación rocía las botellas de solución de desprendimiento de medio y celda con 70% de etanol y límpialas con toallas de papel. Transfiera las botellas limpias a la capucha de cultivo de tejido. Después de esto, recupere las placas de seis pozos de la incubadora.
Pipetee cuidadosamente los medios acondicionados en tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros y coloque los tubos sobre hielo. Agregue 0,5 mililitros de solución de desprendimiento celular en cada pozo de las placas de seis pozos, y compruebe cada minuto si las células tumorales se han redondeado hacia arriba. Una vez que las células tumorales se redondeen, toque suavemente el lado de la placa para ayudar a separar las células.
Próxima pipeta 2,5 mililitros de medio de mantenimiento de la célula tumoral en el pozo y pipeta arriba y abajo tres veces para mezclar. Transfiera las células a un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Mezclar 10 microlitros de células con 10 microlitros de solución Trypan Blue, y transferir 10 microlitros de esta mezcla en el portaobjetos.
Utilice un contador automático de células para cuantificar el número de células vivas y utilice el medio de células madre libre de suero que se incuba a 37 grados centígrados durante la noche para ajustar el volumen de los medios acondicionados de acuerdo con el número de célula. Filtre el medio acondicionado a través de filtros de 0,45 micrómetros y coloque los medios acondicionados sobre hielo. Para empezar, calienta el medio IMDM en un baño de agua a 37 grados Centígrados durante 20 minutos.
Limpie la capucha de cultivo de tejido con 70% de etanol y limpie la botella de medio y transportela a la campana como se describió anteriormente. A continuación, transfiera el matraz de células MV-4-11 al capó. Pipetear 10 mililitros de células en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Utilice Trypan Blue y un contador de celdas automático para cuantificar el número de celdas vivas como se describió anteriormente. Luego centrifugar las células a 200 veces g y a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 10 mililitros de PBS.
Centrifugar de nuevo a 200 veces g y a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en el medio IMDM a una densidad de células final de un millón de células por mililitro. Primero lleve los materiales necesarios a temperatura ambiente.
Agregue 250 microlitros de las células MV-4-11 preparadas a cada plaquita. A continuación añadir 400 microlitros del medio acondicionado o medio sólo a las cámaras inferiores de la placa de 24 pozos, asegurándose de añadir las muestras en triplicado. Incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas.
A continuación, toque suavemente la plaquita en la pared interior del mismo pozo y deseche la plaquita. Pipetear suavemente las celdas de los pozos hacia arriba y hacia abajo tres veces para mezclar. Transfiera 225 microlitros de esta suspensión celular a los pozos de una placa de 96 pozos de paredes negras adecuada para la medición de fluorescentes.
Después de esto, diluir el tinte CyQUANT con tampón de 4x lisis en una proporción de uno a 75. Vortex brevemente y gire hacia abajo la solución. Transfiera 75 microlitros de esta solución a cada pozo de la placa de 96 pozos e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Con un lector de placas de fluorescencia, lea la fluorescencia y analice los datos tal como se describen en el protocolo de texto. En este estudio, se utiliza un ensayo in vitro para estudiar la interacción de los macrófagos tumorales. Las muestras con valores altos de fluorescencia indican que los medios condicionados tienen una alta capacidad para reclutar macrófagos.
Dependiendo de la necesidad experimental, se pueden incluir controles adicionales. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos neutralizantes para tratar los medios condicionados para abolir la quimiotaxis de macrófagos y realizar de la misma manera. También se pueden añadir quimioquinas adicionales a los medios acondicionados, que sirven como un control positivo.
Es importante controlar las diferencias de número de celda para este ensayo porque diferentes tipos de células pueden crecer a diferentes velocidades. La confirmación in vivo de los resultados in vitro es fundamental. Se pueden inyectar células tumorales en ratones y analizar los tumores con citometría de flujo, inmunosu manchado y CyTOF para confirmar los resultados.
