Nuestro protocolo describe la modificación genética de las células CAR-T durante su fabricación a través de la tecnología CRISPR para generar un producto más eficaz y menos tóxico. Una ventaja de esta técnica es que la producción de células CAR-T y la manipulación genética pueden ocurrir en una célula con buena eficiencia. Demostrando el procedimiento estarán Rosalie Sterner, una estudiante de doctorado, Michelle Cox, una tecnóloga y una estudiante de posgrado, y Reona Sakemura, una estudiante de postdoctorado, de mi laboratorio.
Después de aislar las células T de las células mononucleares de sangre periférica cosechadas, comience a cultivarlas primero preparando el medio de células T y luego esterilizando filtrando a través de un filtro de vacío estéril de 0,45 micrómetros y luego con un filtro de vacío estéril de 0,22 micrómetros. El día de la estimulación de la célula T o el día cero, antes de la estimulación, lave las perlas CD3/CD28 colocando el volumen requerido de perlas en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro y resuspendiendo en un mililitro de TCM. Coloque el tubo en contacto con un imán durante un minuto.
A continuación, aspirar la MTC y resuspend en un mililitro de MTC fresco para lavar las cuentas de nuevo y repetir para un total de tres lavados. Y finalmente, resuspender las cuentas en un mililitro de TCM. Después de contar las células T, transfiera las cuentas a las células T en una proporción de tres a una cuentas a las células.
Luego diluir las células a una concentración final de un millón de células por mililitro e incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 durante 24 horas. Después de adquirir una construcción CART19 en un vector lentiviral, realice la producción lentiviral incubando primero plásmido lentiviral, vector de embalaje, vector de envolvente, reactivo precomplejo, reactivo de transfección y medio de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. Llevar a cabo trabajos lentivirales utilizando BSL2+precauciones incluyendo campanas de cultivo celular, equipos de protección personal y desinfección de materiales usados con lejía antes de su eliminación.
Después de la incubación, agregue estos reactivos de transfección a las 293 células T que han alcanzado 70 a 90%confluencia y cultivo de las células trans infectadas a 37 grados Celsius y 5%CO2. A las 24 y 48 horas después de la transfección, cosecha, centrífuga, filtro y concentrado sobrenadante que contiene virus por ultracentrifugación y congelación a menos 80 grados Centígrados para uso futuro. En el primer día, resuspend suavemente células T que han sido estimuladas en un millón de células por mililitro en el día cero con el fin de romper las rosetas de las células.
Bajo las precauciones apropiadas de BSL2+, agregue el virus cosechado fresco o congelado a las células T simuladas a una multiplicidad de infección de 3.0. Continúe incubando las células T transducidas a 37 grados Celsius, 5%CO2. En los días tres y cinco, cuente las células CAR-T y agregue TCM precale calentado fresco al cultivo para mantener una concentración de células CAR-T de un millón de células por mililitro.
Seis días después de la simulación, retire las cuentas de las células T transducidas cosechando primero y resuspendiendo las células. Transfiera las células en tubos cónicos de 50 mililitros y coloque los tubos en un imán durante un minuto. Después de recoger el sobrenadante que contiene células CAR-T y descartar las cuentas, vuelva a colocar las células en cultivo a una concentración de un millón de células por mililitro en un matraz de cultivo.
Utilice una muestra de células para la citometría de flujo para evaluar la expresión superficial de los CAR. Incubar el resto para reanudar la expansión y luego cosechar y crio-preservar las células en el día ocho como se describe en el manuscrito. Para interrumpir el factor estimulante de la colonia de macrófagos de granulocitos, utilice un ARN guía como se describe en el manuscrito.
Incubar reactivos de transfección a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, agréguelos a las 293 células T que han alcanzado entre 70 y 90%confluencia y cultivo de las células trans infectadas a 37 grados celsius, 5%CO2 para producir un lentivirus. A las 24 y 48 horas, cosecha y concentra el sobrenadante que contiene virus mediante ultracentrifugación en tubos ultracentrífugos de 50 mililitros y congela a menos 80 grados centígrados para uso futuro.
Luego, el primer día, resuspender suavemente las células T para romper las rosetas. En un laboratorio aprobado por BSL2+, para generar células CAR-T, agregue el lentivirus CAR19 y el lentivirus CRISPR dirigido al GMCSF a las células T simuladas. En el día tres y cinco para las células T editadas con lentiCRISPR transducidas con éxito que transportan resistencia a la puromicina, tratar las células con dihidrocloruro de puromicina a una concentración de un microgramo de puromicina por mililitro.
La secuenciación de mareas se utilizó para confirmar una reducción de GM-CSF en células GM-CSF knockout CART19 con una eficiencia de interrupción de aproximadamente 71% Parcelas de flujo de tinción de superficie de células CAR-T cerradas en células CD3 positivas en vivo muestran que tanto el tipo salvaje CART19 como GM-CSF knockout CART19 expresan con éxito el receptor de superficie CAR in vitro. Por otro lado, la tinción intracelular de GM-CSF por citometría de flujo también cerrada en células CD3-positivas en vivo demuestra una disminución de la expresión de GM-CSF en las células nocauts en comparación con las células CART19 de tipo salvaje que confirman el éxito funcional del knockout. Se debe tener especial cuidado durante las medidas de transducción de este procedimiento, ya que son las más críticas para el desarrollo de células CAR-T modificadas genéticamente.
La metodología descrita puede aplicarse potencialmente a una variedad de genes para modificar las células CAR-T a través de CRISPR/CAS9 para ayudar a generar un producto menos tóxico y más eficaz. La tecnología CRISPR/CAS9 proporciona las estrategias para orientar directamente el genoma de las células CAR-T para diseñar soluciones a las deficiencias clínicas actuales.
