Este método permite el modelado preciso de mutaciones leucemogénicas recurrentes de ganancia de función en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas primarias y, por lo tanto, investigar el papel en la transformación leucémica. La principal ventaja de esta técnica es que la ingeniería de mutaciones basada en CRISPR-Cas9 se combina con la introducción de un reportero fluorescente. Esto permite de forma única la identificación, el enriquecimiento y el seguimiento de poblaciones celulares puras mutadas heterocigotamente.
Demostrando el procedimiento estará Tommaso Sconocchia, un investigador postdoctoral de mi laboratorio. Para comenzar, diseñe el ARN guía único utilizando la herramienta de diseño Benchling en línea seleccionando la opción de creación más. Luego, haga clic en la opción "secuencia de ADN" seguida de importar secuencias de ADN" e importar desde bases de datos.
Luego ingrese el gen deseado y seleccione "humano" como la especie. Haga clic en la opción "buscar" y seleccione la importación de transcripción correcta. Seleccione la región de interés en la que desea introducir la ruptura de doble hebra.
Luego seleccione la opción CRISPR "en el lado derecho de la pantalla, seguido de guías de diseño y análisis. A continuación, seleccione una sola guía" mientras mantiene la longitud de la guía en 20 pares de bases y la secuencia PAM para editar con SP-Cas9. Elija una guía con una puntuación alta en el objetivo y una puntuación alta fuera del objetivo y solicite el ARN guía único como un ARN guía único sintético modificado químicamente de un proveedor comercial.
Para diseñar la plantilla HDR, importe la secuencia genómica y la secuencia de codificación en el software para la clonación molecular. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología izquierdo seleccionando, idealmente, 400 pares de bases en el extremo primo de los cinco saltos de doble cadena y pegue esta secuencia en un nuevo archivo. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe la secuencia aceptora de empalme seleccionando los últimos 150 pares de bases del intrón objetivo y pegándolo después del brazo de homología izquierdo.
En el archivo de secuencia de codificación, seleccione el ADNc que le interese. Codon optimiza el ADNc e insértalo después de la secuencia aceptora de empalme. Después del ADNc de interés, inserte una señal de poliadenilación de tres primos siguiendo una secuencia promotora para la proteína fluorescente.
Luego, inserte la secuencia para la proteína fluorescente y una segunda, pero diferente señal de poliadenilación. A partir del archivo de secuencia genómica, diseñe el brazo de homología derecho seleccionando idealmente 400 pares de bases en el extremo principal de las roturas de doble cadena e inserte la secuencia después de la segunda poliadenilación. Luego, cree una copia de toda la plantilla y modifique el ADNc de interés para que contenga la secuencia de la mutación deseada.
Intercambie la proteína fluorescente con una proteína fluorescente diferente. Construya y clone las plantillas HDR en el vector de expresión AAV. Para la preparación recombinante de AAV6, prepare 10 platos de 150 milímetros cada uno con 11 millones de HECK293T en 20 mililitros de DMEM suplementados con 10% FBS, 1% de estreptomicina de penicilina y 25 HEPES milimolares.
Luego, coloque los platos en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante 24 horas. Después de desechar cuidadosamente el medio viejo, reemplácelo con 20 mililitros de DMEM libre de antibióticos suplementado con 10% FBS, 25 milimolares HEPES y un butirato de sodio milimolar. A continuación, prepare dos tubos de 15 mililitros etiquetados como tubos uno y dos.
Al tubo uno, agregue cinco mililitros de medio sérico reducido, 60 microgramos de plásmido HDR recombinante con mutación AAV6 y 220 microgramos de plásmido auxiliar PDGM6. Al tubo dos, agregue cinco mililitros de medio sérico reducido y 1120 microlitros de un miligramo por mililitro de solución de polietilenoamina. Después de agregar el contenido del tubo dos al tubo uno, vórtice durante 30 segundos y luego incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Agregue cuidadosamente 1.1 mililitros de la solución a cada plato y distribúyala girando suavemente. Coloque los platos en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante 48 horas. Luego agregue 250 microlitros de 0.5 molar EDTA a cada plato y colóquelos en la incubadora durante 10 minutos.
Cosecha las células lavándolas del plato y transfiérelas a un tubo de centrífuga de 500 mililitros. Centrifugar a 2000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Afloje el pellet mediante vórtice y extraiga el virus utilizando un kit de purificación AAV.
Después de alícuota el virus purificado, guárdelo a menos 80 grados centígrados. Después de descongelar las células madre hematopoyéticas CD34 positivas y progenitoras, transfiera las células a 10 mililitros de RPMI precalentado suplementado con estreptomicina al 1% de penicilina. Centrifugar a 350 g a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Suspender las células en medio de retención de células madre y progenitoras hematopoyéticas a una concentración de 250, 000 células por mililitro e incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. A continuación, cosecha las células en un tubo de 15 mililitros. Contar y comprobar la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano.
Para preparar el complejo ribocucleoproteico, agregue 15 microgramos de Cas9 y ocho microgramos de ARN guía único en un tubo de 1.5 mililitros e incube a 25 grados centígrados durante 10 minutos en un bloque de calentamiento. Mientras el complejo ribonucleoproteína se está incubando, centrifugar las células a 350 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Después de suspender las células en 100 microlitros de solución de nucleofección, mezcle las células con el complejo de ribonucleoproteína y transfiéralas a la cubeta.
Después de golpear suavemente la cubeta para eliminar cualquier burbuja de aire residual, inserte la cubeta en el soporte del sistema de transfección y electropolara las células. Inmediatamente después de la electroporación, añadir 400 microlitros de medio de retención de células madre y progenitoras hematopoyéticas precalentadas sin estreptomicina penicilina y transferir las células con una pipeta de transferencia fina a una placa de cultivo que contenga un medio de retención de células madre hematopoyéticas y progenitoras precalentado sin estreptomicina penicilina. Luego transfiera la placa a la incubadora.
Descongele los viales que contienen los AAV recombinantes congelados en hielo y transduca las células pipeteando la cantidad óptima de cada AAV6 recombinante a la suspensión celular. Después de mezclar suavemente la suspensión celular con la pipeta, incubar las células transducidas durante seis a ocho horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de seis a ocho horas, recoger las células en un tubo y centrifugarlas a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y reemplácelo con un nuevo medio de retención de células progenitoras y madre hematopoyética precalentado complementado con estreptomicina de penicilina y transfiera las células a una placa de cultivo celular. Incubar las células durante 48 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para clasificar las células modificadas que llevan la mutación heterocigótica de ganancia de función, recolecte las células en un tubo de 15 mililitros y centrifugar a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos como se demostró anteriormente.
Retire el sobrenadante y suspenda las células en un mililitro de DPBS que contenga 0,1% de PSA y centrifugar nuevamente a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, suspenda las células en un volumen apropiado de DPBS más 0.1% BSA dependiendo del número de células como se demostró anteriormente. Transfiera las células a un tubo de fax estéril equipado con una tapa y agregue siete AAD u otro tinte de viabilidad a la suspensión celular para la exclusión de células vivas / muertas.
Clasifique las células vivas que son doblemente positivas para las proteínas reporteras fluorescentes en un tubo de recolección que contenga 200 microlitros de madre hematopoyética y medio de retención de células progenitoras. Después de centrifugar las células clasificadas a 350 G a temperatura ambiente durante cinco minutos como se demostró anteriormente, a una concentración de 250, 000 células por mililitro para una mayor expansión en cultivo o utilizar las células directamente para ensayos funcionales. Dos días después de la transvección con el complejo ribonucleoproteína y la transducción con los virus AAV6 recombinantes, las células se analizaron mediante citometría de flujo.
Se detectaron cuatro poblaciones principales, incluidas las células sin edición del genoma basada en HDR que no expresan ni las células GFP ni las BFP positivas solo para GFP con solo la construcción de tipo salvaje integrada, las células positivas solo para BFP con solo la construcción mutada integrada, y las células GFP y BFP doble positivas con el tipo salvaje y las secuencias mutadas integradas. Para validar el knock-in exitoso de las mutaciones heterocigotas de calreticulina in/out se realizó PCR en ADN genómico extraído de células incubadas solo con AAV y de células incubadas con la ribonucleoproteína y AAV con el tipo salvaje de calreticulina knocked-in y la secuencia de deleción de calreticulina. Las células se clasificaron en función de la expresión simultánea de ambos reporteros de fluorescencia antes de la extracción de ADN.
Después de la electroforesis en gel, se extirparon bandas individuales del gel y se extrajo ADN para la posterior secuenciación de Sanger. Los resultados de la secuenciación confirmaron la integración perfecta exitosa del tipo salvaje y las secuencias mutadas en las células madre y progenitoras hematopoyéticas heterocigotas mutadas en calreticulina. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es seleccionar cuidadosamente el ARN guía único de mejor rendimiento, ya que esto determinará la eficiencia general de HDR y, por lo tanto, la frecuencia de éxito de mutaciones heterocigotas.
Después de este procedimiento, las células genéticamente modificadas se pueden utilizar para experimentos funcionales in vitro e in vivo, como ensayos de unidades formadoras de colonias, ensayos de diferenciación y trasplante en ratones inmunodeficientes.
