La electroporación de ARNm proporciona una expresión rápida, eficiente y controlada espacial y temporalmente de múltiples proteínas dentro del sistema modelo aviar. Este método permite una expresión más amplia y rápida de proteínas fluorescentes que el etiquetado logrado por la electroporación de ADN estándar. La electroporación facilita la apertura transitoria de los poros en la membrana plasmática que sirven como conductos para la transferencia de cargas genéticas como el ARN y el ADN a las células de numerosos organismos modelo.
Para los experimentos iniciales trabajan con embriones que tienen más de un día de edad, ya que son más duros y más resistentes a manipulaciones externas como la electroporación. En la etapa de desarrollo embrionaria apropiada, romper suavemente y verter el contenido del huevo de codorniz en un plato de Petri de 10 centímetros. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la mayoría del alúbmina grueso.
Utilice un tejido de laboratorio para limpiar suavemente la superficie del yugo para eliminar el albúmina grueso restante alrededor del embrión para asegurarse de que el embrión se pegue firmemente al anillo de papel. Poner papel de filtro precortado sobre el embrión y utilizar tijeras para cortar suavemente alrededor del perímetro del embrión. Utilice una pipeta Pasteur para poner ppS debajo del embrión utilizando corrientes suaves para desalojar cualquier yugo que se pegue al tejido.
Tire lentamente del anillo de papel embrionario en un ángulo oblicuo hacia arriba y hacia fuera del yugo. Coloque el papel en un plato de Petri lleno de PBS para su posterior limpieza. Una vez que la mayor parte del yugo ha sido removido, coloque el lado ventral embrionario hacia arriba en un plato petri de 35 milímetros cubierto con una mezcla semisólida de agar y albúmina.
Prepare la cámara de electroporación conectando el electrodo negro llenándolo con PBS y colocando el embrión dentro. Utilice un microcapilar de vidrio para inyectar un bolo de 200 nanolitros de ARNm en la cavidad entre la membrana de epíblasto y vitellina que cubre la región deseada. Y luego usa el electrodo rojo para electroporar el embrión.
Coloque el embrión electroporado de nuevo en la mezcla de agar-albumen e incubar a 38 grados centígrados hasta la etapa de desarrollo deseada. Para la toma de imágenes de las proteínas fluorescentes codificadas por electroporación observar todos los embriones electroporados bajo un estereoscopio disección fluorescente para seleccionar el embrión electroporado más saludable y mejor para los experimentos de imagen dinámica. Continúe incubando los otros embriones electroplacados y embriones no electroplacados en una incubadora separada.
Enjuague brevemente el embrión seleccionado con PBS para eliminar cualquier burbuja que pueda haberse formado en el lado dorsal del embrión durante la electroporación. Coloque el embrión limpio directamente en un plato de imágenes que contenga una capa delgada de unos 150 microlitros de agar albúmina teniendo cuidado de no generar burbujas en la superficie dorsal del embrión. Agregue un pequeño pedazo de papel tisú enrollado húmedo a lo largo de los bordes interiores de la placa de imágenes.
Selle el plato con película de parafina para minimizar la evaporación durante la toma de imágenes y la incubación. Mueva el plato rápidamente a la etapa precalificada de un microscopio confocal y utilice el canal brightfield para localizar el tinte de color en el embrión. Establezca el software de imágenes en el objetivo deseado, el espejo dicroico y los espectros de emisión, y encienda un láser adecuado.
Tenga cuidado de que las celdas permanezcan en la visión de la imagen durante toda la película. Utilice una resolución de imagen lo suficientemente alta y asegúrese de que las condiciones de diagnóstico por imágenes no causen fototoxicidad. Haga clic en Live en el software de imágenes y ajuste la potencia del láser a un ajuste adecuado para la intensidad de fluorescencia dependiendo de cada potencia láser del microscopio.
Comience a tomar imágenes del embrión con un 1% de potencia láser y una ganancia de 800, aumentando la potencia del láser lentamente en un 1% de incrementos hasta que se vean píxeles saturados. Cuando se observan píxeles saturados, disminuya ligeramente la potencia del láser hasta que no se puedan visualizar píxeles saturados. Imagínose el embrión cada tres a cinco minutos para comprobar la migración de células individuales a través de diferentes puntos de tiempo utilizando pilas Z de cinco micrómetros de toda el área electroplacada con algo de espacio adicional hacia la parte inferior de la pila Z en caso de que el embrión se hunda en el lecho de agarosa durante la sesión de imágenes.
Para observar la velocidad a la que se mueven las celdas, compruebe los primeros puntos de tiempo de la primera película. Si las celdas se mueven a una velocidad rápida, considere la posibilidad de ampliar el zoom del área de imagen o tomar imágenes de una región diferente. Cuando se ha visualizado toda la región electroplacada del embrión, la imagen en la región noelectromada del mismo embrión para determinar los niveles de autofluorescencia.
Para determinar cuánto tiempo el ARNm trans infectado se puede traducir en proteínas fluorescentes después de confirmar la electroporación del gen de interés en el microscopio estéreo, coloque el embrión en una etapa precalentada del microscopio confocal invertido y utilice el láser de 405 nanómetros con una potencia láser del 70%, 100 iteraciones y una velocidad de escaneo de cuatro fotoblanchos la mayor parte del fluorescencia celular del gen de la tecnología electroplatada en un nivel de una variedad. Continuar incubando los embriones en la etapa a 36 grados Celsius después del blanqueo fotográfico, teniendo cuidado de prestar atención a las células que se dividen activamente dentro de la región fotoblancada que normalmente sólo se ven en embriones sanos y así indicar que la electroporación no dó dañar las células embrionarias. Adquiera imágenes de pila Z posteriores a la lejía de la región electroplacada durante el tiempo deseado en intervalos de tiempo regulares de tres a cinco minutos.
Para garantizar que las condiciones de diagnóstico por imágenes no afecten al embrión simultáneamente incubar embriones electroplacados que no están fotoblancados para servir como control de la toma de imágenes. Para cuantificar los resultados de fotoblanqueo para la descomposición del ARNm post-electroporación utilice ImageJ para medir la intensidad de fluorescencia de un círculo de 7,5 micrómetros en el centro del área electroplacada de cada célula para rastrear la fluorescencia celular en cada intervalo de tres a cinco minutos. Cuando se hayan medido todas las células dentro de la región fotoblancada que no están sometidas a mitosis y completamente fotoblancadas, trazar la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo después de la lejía en cada uno de los puntos de tiempo en los que se fotoblanqueó el embrión.
Aunque la electroporación del ADN conduce a una fluorescencia más brillante en algunas células electroplacadas, la eficiencia de la electroporación del ADN es visiblemente menor en comparación con las proteínas fluorescentes codificadas con ARNm ampliamente expresadas. Al comparar la coelectroración de ADN y ARNm dentro del mismo embrión, el ADN que expresa la eficiencia de la proteína fluorescente también es significativa y consistentemente menos eficiente que la del ARNm que expresa proteína fluorescente. La cuantificación de todos los embriones electroplacados con sólo ARNm, ADN o una combinación de los dos, revela que el ARNm transfecta alrededor del 75% de las células de una región dada, mientras que el ADN sólo transfecta alrededor del 25% de las células.
El ARNm trans infectado debe conducir a una producción de proteínas más rápida en comparación con el ADN trans infectado, ya que el ARNm puede ser reconocido inmediatamente por la maquinaria de traducción citosólica. Aunque la co-electroporación de múltiples DNAs se ha demostrado previamente que es relativamente ineficiente, la co-electroporación de cuatro mRNAs en este experimento dio lugar a una eficiencia de transfección del 87%de los cuatro mRNAs dentro de todas las regiones electroplacadas. Aunque el fotoblanqueo inicialmente reduce la intensidad de la fluorescencia en las células fotoblanqueadas en aproximadamente un 95%, quedan algunas células que recuperan su capacidad de dividir y expresar proteínas fluorescentes poco después de la electroporación.
Sin embargo, esta capacidad disminuye más de cinco horas después de la electroporación. Tómese su tiempo optimizando las mejores condiciones de imagen y continúe retoque incluso después de comenzar la película, estando listo para hacer cualquier ajuste si es necesario.
