mRNA elektroporasyonu, kuş modeli sistemi içinde birden fazla proteinin hızlı, verimli ve mekansal ve zamansal olarak kontrol edilen bir ekspresyonu sağlar. Bu yöntem, floresan proteinlerin standart DNA elektroporasyonu ile elde edilen etiketlemeden daha geniş ve hızlı bir şekilde ifade edilmesine olanak sağlar. Elektroporasyon, RNA ve DNA gibi genetik yüklerin çok sayıda model organizmaların hücrelerine aktarılmasıiçin kanal görevi gösteren plazma zarındaki gözenekleri geçici olarak açmayı kolaylaştırır.
İlk deneyler için onlar daha sert ve elektroporasyon gibi dış manipülasyonlara karşı daha dayanıklı olduğundan bir gün eski daha eski embriyolar ile çalışmak. Uygun embriyonik gelişim aşamasında yavaşça kırmak ve 10 santimetre Petri çanak içine bıldırcın yumurtası içeriğini dökün. Kalın albumençoğunluğu kaldırmak için bir transfer pipet kullanın.
Embriyokağıt halkasıkıca sopa sağlayacak emin olmak için embriyo etrafında kalan kalın albumen kaldırmak için boyunduruğun yüzeyini nazikçe silmek için bir laboratuvar dokusu kullanın. Embriyo nun üzerine önceden kesilmiş filtre kağıdı nı atın ve embriyonun çevresini düzgün bir şekilde kesmek için makas kullanın. Dokuya yapışan boyunduruğu boşaltmak için nazik akarsular kullanarak embriyonun altındaki PPS katmanı için pasteur pipet kullanın.
Yavaş yavaş eğik bir açıyla embriyo kağıt halka çekin yukarı ve boyunduruk kapalı. Daha fazla temizlik için PBS ile dolu bir Petri kabına kağıt yerleştirin. Boyunduruğun çoğu çıkarıldıktan sonra, embriyo ventral tarafını agar ve albumenin yarı katı karışımıyla kaplı 35 milimetrelik Petri kabına yerleştirin.
Siyah elektrotp PBS ile doldurarak ve içine embriyo yerleştirerek elektroporasyon odası hazırlayın. İstenilen bölgeyi kaplayan epiblast ve vitellin membran arasındaki kaviteye 200 nanolitre mRNA bolus enjekte etmek için cam mikrokapiller kullanın. Sonra da embriyoyu elektroporate etmek için kırmızı elektrot kullanın.
Elektroporated embriyo geri agar-albumen karışımı üzerine yerleştirin ve istenilen gelişim aşamasına kadar 38 santigrat derece kuluçka. Elektroporasyon kodlu floresan proteinlerin görüntülenmesi için, dinamik görüntüleme deneyleri için en sağlıklı ve en iyi elektroporated embriyoyu seçmek için floresan diseksiyon stereoskopu altındaki tüm elektroporated embriyoları gözlemler. Diğer elektroplakalı embriyoları ve elektroplakasız embriyoları ayrı bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatırmaya devam edin.
Kısaca elektroporasyon sırasında embriyonun dorsal tarafında oluşmuş olabilecek kabarcıkları kaldırmak için PBS ile seçilen embriyo durular. Temizlenmiş embriyoyu doğrudan, embriyonun sırt yüzeyinde kabarcık oluşturmamaya özen gösterirken yaklaşık 150 mikrolitre albumen-agar içeren ince bir tabaka içeren bir görüntüleme kabına yerleştirin. Görüntüleme çanak iç kenarları boyunca küçük bir nemli doku kağıt parçası rulo ekleyin.
Görüntüleme ve kuluçka sırasında buharlaşmayı en aza indirmek için çanak parafin film ile kapatın. Bir konfokal mikroskobun önceden ısıtılmış aşamasına hızlı bir şekilde çanak taşıyın ve embriyo renkli boya bulmak için brightfield kanalını kullanın. Görüntüleme yazılımını istenilen hedefe, dikroik aynaya ve emisyon spektrumlarına ayarlayın ve uygun bir lazeri açın.
Hücrelerin filmin tamamı için görüntü görüşünde kalmasına dikkat edin. Yeterince yüksek görüntüleme çözünürlüğü kullanın ve görüntüleme koşullarının fototoksisiteye neden olmadığından emin olun. Görüntüleme yazılımında Canlı'yı tıklatın ve lazer gücünü her mikroskop lazer gücüne bağlı olarak floresan yoğunluğuna uygun bir ayara ayarlayın.
Embriyoyu %1 lazer gücü ve %800 kazanç kullanarak görüntülemeye başlayın, doymuş pikseller görülene kadar lazer gücünü yavaş yavaş %1 artırın. Doymuş pikseller gözlendiğinde, doymuş pikseller görselleştirilene kadar lazer gücünü biraz azaltın. Embriyonun görüntüleme seansı sırasında agarose yatağına batması durumunda, tüm elektroplakalı alanın beş mikrometre Z-destesini kullanarak farklı zaman noktaları arasında tek tek hücrelerin geçişini kontrol etmek için embriyoyu her üç ila beş dakikada bir görüntüleyin ve z-yığınının dibine doğru fazladan bir oda yerleştirin.
Hücrelerin ne kadar hızlı hareket ettigini gözlemlemek için ilk filmin ilk birkaç zaman noktasini kontrol edin. Hücreler hızlı bir hızda hareket ediyorsa, görüntüalanının yakınlaştırmasını genişletmeyi veya farklı bir bölgeyi görüntülemeyi düşünün. Embriyonun tüm elektroplakalı bölgesi görüntülendiğinde, otofloresans düzeylerini belirlemek için aynı embriyonun elektroplakasız bölgesinde görüntü.
Stereo mikroskoptaki ilgi geninin elektroporasyonunun onaylanmasından sonra transfected mRNA'nın ne kadar süre floresan proteinlere çevrilebileceğini belirlemek için, ters konfokal mikroskobun önceden ısıtılmış bir evreye embriyo yerleştirin ve 405 nanometre lazer% 70 lazer gücü, 100 yineleme ler ve dört bir tazyik hızı ile çeşitli zaman noktalarında elektroplakalı gen hücresel floresan en fotobleach için kullanın. Fotoğraf beyazlatma sonra 36 santigrat derece sahnede embriyolar kuluçkaya devam, genellikle sadece sağlıklı embriyolarda görülen fotobleached bölge içinde aktif olarak bölünen hücrelere dikkat dikkat ve böylece elektroporasyon embriyonik hücrelere zarar vermedi gösterir. Düzenli üç ila beş dakikalık zaman aralıklarında istenilen süre için elektroplated bölgenin post-bleach Z-stack görüntüleri elde.
Görüntüleme koşullarının silinmeden embriyo sağkalımını aynı anda etkilememesini sağlamak için fotobleached olmayan elektroplakalı embriyolar görüntüleme için bir kontrol görevi görmek için kullanılır. MRNA bozunması elektroporasyon sonrası fotobeyazrlama sonuçlarını hesaplamak için, her hücrenin elektroplated alanının ortasında7,5 mikrometrelik bir dairenin floresan yoğunluğunu ölçmek için ImageJ'i kullanarak hücre floresansını her üç ila beş dakikalık aralıkta takip edin. Mitoz geçirilen ve tamamen fotobeyazlatılmış olan fotobeyaznlanmış bölgedeki tüm hücreler ölçüldüğünde, zaman sonrası çamaşır suyu üzerindeki floresan yoğunluğu, embriyonun fotobeyaztlandığı her zaman noktasında çizin.
DNA elektroporasyonu bazı elektroplakalı hücrelerde daha parlak bir floresan yol açsa da, DNA elektroporasyonunun etkinliği yaygın olarak ifade edilen mRNA kodlanmış floresan proteinlere göre gözle görülür şekilde daha düşüktür. Aynı embriyo içinde DNA ve mRNA ko-elektroporasyon karşılaştırırken, floresan protein verimliliğini ifade eden DNA da önemli ve tutarlı olarak floresan protein ifade mRNA daha az verimlidir. Sadece mRNA, DNA veya ikisinin bir kombinasyonu ile elektroplated tüm embriyoların quantification, mRNA belirli bir bölgedeki hücrelerin yaklaşık% 75 transfects ortaya koymaktadır, DNA sadece hücrelerin yaklaşık% 25 transfects.
Transfected mRNA, transfekterik DNA'ya göre daha hızlı bir protein üretimine yol açmalıdır, çünkü mRNA sitosolik çeviri makineleri tarafından hemen fark edilebilir. Birden fazla DNA'nın birlikte elektroporasyonunun daha önce nispeten verimsiz olduğu gösterilmiş olsa da, bu deneyde dört mRNA'nın birlikte elektroporasyonu, elektroplated bölgelerin tümündeki dört mRNA'nın da %87 transfeksiyon verimliliğiile sonuçlanmıştır. Fotobeyaztasyon başlangıçta fotobeyazlama hücrelerindeki floresan yoğunluğunu yaklaşık %95 oranında azaltsa da, elektroporasyondan kısa bir süre sonra floresan proteinleri bölebilme ve ifade etme yeteneklerini geri alan bazı hücreler kalır.
Ancak bu yetenek elektroporasyon sonrası beş saatten fazla azalır. En iyi görüntüleme koşullarını optimize etmek için zaman ayırın ve gerekirse herhangi bir ayarlama yapmaya hazır olan filme başladıktan sonra bile tamiretmeye devam edin.
