La edad, la infección y los medicamentos ototóxicos pueden causar la degeneración de las células ciliadas del oído interno, lo que en nosotros conduce a la pérdida de audición. En vertebrados no mamíferos, como el pollo, las células ciliadas pueden regenerarse. Las técnicas descritas aquí hacen uso de la rentabilidad de trabajar en embriones de pollo, la facilidad de obtención de embriones y el buen desarrollo exo de los explantes de tejidos.
Comprender el desarrollo y la regeneración de los pelos del oído interno aviar puede proporcionar información importante sobre la pérdida auditiva y las posibles terapias, y el cultivo de explantes puede ser importante para evaluar los efectos ototóxicos de varios medicamentos. Antes de comenzar el experimento, obtenga huevos recién puestos y límpielos con etanol al 70% para evitar la contaminación. Incubar los huevos durante 3,5 a 4 días, a 37 a 38 grados centígrados con 45% de humedad.
Después de la incubación, vuelva a colocar el embrión en la parte superior de la yema, colocando un huevo de lado durante cinco minutos. Luego, use fórceps para hacer un pequeño orificio en la parte superior y el extremo romo del huevo para que pase una aguja de calibre 21. Con una jeringa de cinco mililitros y una aguja de calibre 21, retire dos mililitros de albúmina de un orificio en el extremo romo del huevo.
Cubra el orificio en el extremo romo con cinta transparente. Para hacer que la ventana del huevo fije la cinta transparente a la parte superior de la cáscara del huevo. Sostenga las agujas de la microinyección de capilares de vidrio estándar utilizando un extractor de pipeta vertical.
Después de tirar, rompa la punta capilar con pinzas finas para obtener un diámetro de punta de aproximadamente 50 micrómetros con un extremo cónico. Para el experimento de eliminación de genes, mezcle las tres construcciones, a saber, el plásmido guía, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP en una proporción de uno a uno a uno con un microgramo de proteína SP Cas9, 30% de sacarosa y 0.1% de colorante verde rápido, y un volumen final de 10 microlitros. Al electroporar múltiples plásmidos, asegúrese de que la concentración final de ADN sea de al menos cuatro microgramos por microlitro.
Con la ayuda de tijeras de arco de resorte, abra alrededor de una ventana de dos centímetros de largo y 1,5 centímetros de ancho, y exponga el embrión. Luego use fórceps para abrir las membranas coriónicas que recubren el embrión, permitiendo el acceso al embrión. Inyecte alrededor de 200 nanolitros de volumen de mezcla de solución de ADN para llenar la vesícula ótica.
Para determinar la eficiencia del ARN guía realice un ensayo de endonucleasa T7. Agregue gotas salinas al embrión al 0,719% para reducir la resistencia eléctrica y evitar el sobrecalentamiento. A continuación, coloque el electrodo positivo a través del orificio hecho en el lado romo del huevo y maniobra el electrodo para que quede debajo de la yema.
Coloque el electrodo negativo sobre el otocisto lleno. Para transfectar el plásmido en la vesícula ótica con electroporación, use un generador de pulsos cuadrados y aplique cinco pulsos de 25 voltios durante 100 milisegundos cada uno, con 50 milisegundos de diferencia. Determinar las condiciones empíricamente basándose en una configuración de electroporación individual.
Después de la electroporación, hidratar el embrión añadiendo unas gotas de solución salina al 0,719%. Vuelva a sellar el huevo con cinta transparente y regrese a la incubadora humidificada a 37 a 38 grados centígrados para su posterior incubación. Desinfecte la mesa quirúrgica, la etapa del microscopio y el área circundante con etanol y calor al 70%, o esterilice con alcohol el equipo de microdisección, incluidas las tijeras mínimamente de resorte, el microcuret y dos pares de pinzas finas.
Prepare las placas de disección, incluida una placa de Petri de vidrio con una base de silicona negra, una placa de Petri de plástico de 90 milímetros y una placa de Petri de 60 milímetros. Mantenga PBS refrigerado o la solución salina balanceada de Hanks, también conocida como HBSS, lista para las disecciones. Rompe suavemente el huevo en la placa de Petri de 90 milímetros.
Luego identifique la oreja externa del pollito y transfiera la cabeza a una placa de Petri de 60 milímetros llena de PBS helado. A continuación, oriente el embrión con la parte superior del pico mirando hacia adentro, y sostenga el pico con uno de los pinzas número cinco. Saque los ojos con el segundo número cinco fórceps.
Luego, de rostral a caudal, corte a lo largo del cráneo a lo largo de su línea media y saque el cerebro. Agregue más PBS helado, o HBSS, y ubique los dos otolitos de la lagena como estructuras brillantes al final del conducto coclear y cerca de la línea media. Para aislar dos oídos internos, corte entre las dos lagenas, y muy por encima y por debajo de la región.
Luego, bajo iluminación oblicua, visualice el contorno del oído interno y elimine el tejido extraño y el vestíbulo. Transfiera la cóclea aislada a una placa base de silicona negra con PBS helado. Despegue la cápsula coclear cartilaginosa usando pinzas número cinco para obtener el conducto coclear.
Luego localice la capa ondulada o tegmento del conducto coclear, y retírela usando pinzas número 55 para exponer la papila basilar o PA. A continuación, retire la membrana tectorial para exponer las células ciliadas y las células de soporte utilizando fórceps número 55. Para el cultivo por membrana de la papila basilar, tome una placa de cultivo de tejido de seis pocillos y organice un inserto de membrana de cultivo por pocillo. Extraiga algunos medios en una pipeta de 200 microlitros y luego aspire el explante de papila basilar disecado con un tampón X HBSS.
Transfiera el explante a una membrana y oriente de modo que la papila basilar mire hacia arriba, y el cabello y las células de soporte sean visibles desde la parte superior. Una vez colocado el explante, aspire el tampón HBSS lentamente desde la superficie de la membrana de cultivo. En este proceso, el explante se unirá a la membrana de cultivo.
Llene el pozo de la placa de seis pozos agregando 1.2 mililitros del medio de águila modificado de dulbecco, o medio de cultivo DMEM, entre el inserto de la membrana y la pared del pozo. Para preparar el cultivo de colágeno del conducto coclear, agregue tres gotas de mezcla de colágeno recién preparada en cada pocillo de una placa de cuatro pocillos y transfiera el conducto coclear disecado a cada gota de colágeno. Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados, y 5% de dióxido de carbono para curar la matriz de colágeno.
Para un tratamiento de moléculas pequeñas de los cultivos, reemplazar los medios de cultivo con 700 microlitros de medios suplementados con el modulador farmacológico, como la penicilina, e incubar las placas como se demostró anteriormente. Reemplace el 50% de los medios de cultivo todos los días. Después del tiempo de incubación adecuado, retire los medios de cultivo y utilice los explantes para los ensayos posteriores.
En la configuración de electroporación, el posicionamiento correcto del electrodo resultó en una mayor expresión de GFP en el oído interno en ambos órganos vestibulares y en la papila basilar auditiva que confirma la transfección. CRISPR Cas9 medió la eliminación del gen Atoh1 en el oído interno, lo que resultó en la pérdida de células ciliadas. La eliminación del gen Atoh1 a través de una ovo-electroporación seguida de incubación hasta E10 mostró un desarrollo reducido de células ciliadas en comparación con el control de plásmidos vacíos.
Aunque la electroporación es mosaico, las células electroporadas de control fueron capaces de formar células ciliadas. En muestras electroporadas de ARNg de Atoh1, las células positivas de proteína fluorescente verde nunca mostraron los marcadores de desarrollo de células ciliadas. El cultivo de órganos de la papila basilar en una matriz 3D, como colágeno y tinción con anticuerpos contra el antígeno de las células ciliadas, proporcionó la excelente preservación de la morfología del tejido durante un máximo de cinco días.
La organización de las células ciliadas y las células de soporte se mantuvieron en estas condiciones de cultivo. Los cultivos de órganos en una membrana se pueden mantener hasta por cinco días mientras se mantiene la integridad del haz capilar. Esto se puede ver en la imagen representativa por la localización de la proteína de enlace de punta, protocadherina 15.
Para investigar el desarrollo del haz capilar, las imágenes de mayor resolución, como la microscopía de súper resolución o la microscopía electrónica de barrido, pueden proporcionar más información. Las condiciones estériles deben mantenerse durante todo el procedimiento. Mientras electropo, asegúrese de que los embriones no se sequen.
Al valorar los inhibidores farmacológicos, se puede reducir la concentración para superar cualquier letalidad. Tanto los embriones como los explantes se pueden tomar para experimentos de imágenes. Ya sea realizando microscopía de video en tiempo real o microscopía electrónica confocal de luz estática, como se muestra en el protocolo.
Dada la facilidad y accesibilidad del uso de explantes de oído interno de pollo, podemos usar el medio a través de la detección de prueba para identificar nuevas moléculas esenciales para la regeneración de las células ciliadas.
