L'elettroporazione dell'mRNA fornisce un'espressione veloce, efficiente e controllata spazialmente e temporaneamente di più proteine all'interno del sistema del modello aviario. Questo metodo consente un'espressione più ampia e rapida delle proteine fluorescenti rispetto all'etichettatura ottenuta dall'elettroporazione standard del DNA. L'elettroporazione facilita l'apertura transitoria dei pori nella membrana plasmatica che fungono da condotti per il trasferimento di carichi genetici come RNA e DNA nelle cellule di numerosi organismi modello.
Per gli esperimenti iniziali lavorare con embrioni che hanno più di un giorno di età poiché sono più resistenti e più resistenti alle manipolazioni esterne come l'elettroporazione. Nella fase di sviluppo embrionale appropriata rompere delicatamente e versare il contenuto di uova di quaglia in una piastra di Petri di 10 centimetri. Utilizzate una pipetta di trasferimento per rimuovere la maggior parte dell'albumen spesso.
Utilizzare un tessuto da laboratorio per pulire delicatamente la superficie del giogo per rimuovere l'albume spesso rimanente intorno all'embrione per assicurarsi che l'embrione si attacchi saldamente all'anello di carta. Posare la carta filtrante pretaglio sull'embrione e utilizzare le forbici per tagliare senza problemi intorno al perimetro dell'embrione. Utilizzare una pipetta Pasteur per stratificazione di SPA sotto l'embrione utilizzando flussi delicati per liberare qualsiasi giogo attaccato al tessuto.
Tirare lentamente l'anello di carta embrionale ad un angolo obliquo su e fuori dal giogo. Posizionare la carta in una piastra di Petri riempita con PBS per un'ulteriore pulizia. Una volta rimossa la maggior parte del giogo, posizionare il lato ventrale dell'embrione in una piastra di Petri di 35 millimetri coperta da una miscela semisolida di agar e albume.
Preparare la camera di elettroporazione collegando l'elettrodo nero riempiendolo con PBS e posizionando l'embrione all'interno. Utilizzare un microcapillare di vetro per iniettare un bolo di 200 nanolitri di mRNA nella cavità tra l'epiblasto e la membrana vitellina che copre la regione desiderata. E poi usare l'elettrodo rosso per elettroporare l'embrione.
Riposizionare l'embrione elettroporato sulla miscela agar-albumen e incubare a 38 gradi Celsius fino allo stadio di sviluppo desiderato. Per l'imaging delle proteine fluorescenti codificate con elettroporazione osservare tutti gli embrioni elettroporati sotto uno stereoscopio di sezionazione fluorescente per selezionare l'embrione elettroporato più sano e migliore per gli esperimenti di imaging dinamico. Continuare a incubare gli altri embrioni elettroplaccati e gli embrioni non elettroplaccati in un'incubatrice separata.
Risciacquare brevemente l'embrione selezionato con PBS per rimuovere eventuali bolle che potrebbero aver formato sul lato dorsale dell'embrione durante l'elettroporazione. Posizionare l'embrione pulito direttamente in un piatto di imaging contenente un sottile strato di circa 150 microlitri di albumen-agar facendo attenzione a non generare bolle sulla superficie dorsale dell'embrione. Aggiungere un piccolo pezzo umido arrotolato di carta velina lungo i bordi interni del piatto di imaging.
Sigillare il piatto con pellicola di paraffina per ridurre al minimo l'evaporazione durante l'imaging e l'incubazione. Spostare rapidamente il piatto nella fase prebellica di un microscopio confocale e utilizzare il canale brightfield per localizzare il colorante colorato nell'embrione. Impostare il software di imaging sull'obiettivo desiderato, lo specchio dicroico e gli spettri di emissione e attivare un laser appropriato.
Fare attenzione che le celle rimangano nella visione dell'immagine per l'intero film. Utilizzare una risoluzione di imaging sufficientemente elevata e assicurarsi che le condizioni di imaging non causino fototossicità. Fare clic su Live nel software di imaging e regolare la potenza del laser su un'impostazione appropriata per l'intensità di fluorescenza a seconda della potenza laser del microscopio.
Inizia a immaginare l'embrione usando l'1% di potenza laser e un guadagno di 800, aumentando lentamente la potenza del laser dell'1% fino a quando non vengono visti pixel saturi. Quando si osservano pixel saturi, ridurre leggermente la potenza del laser fino a quando non è possibile visualizzare pixel saturi. Immagine dell'embrione ogni tre o cinque minuti per controllare la migrazione delle singole cellule attraverso diversi punti di tempo utilizzando cinque micrometri Z-stack dell'intera area elettroplaccata con un po 'di spazio extra verso il fondo della pila Z nel caso in cui l'embrione sprofondi nel letto di agarosio durante la sessione di imaging.
Per osservare la velocità con cui le celle si muovono, controllare i primi punti di tempo del primo filmato. Se le celle si muovono a una velocità troppo rapidaa, è consigliabile espandere lo zoom dell'area con immagini o per immaginare un'area diversa. Quando l'intera regione elettroplaccata dell'embrione è stata immagine, immagine in regione non elettrizzata dello stesso embrione per determinare i livelli di autofluorescenza.
Per determinare per quanto tempo l'mRNA trasfetto può essere tradotto in proteine fluorescenti dopo aver confermato l'elettroporazione del gene di interesse sul microscopio stereo, posizionare l'embrione su uno stadio preriscaldato del microscopio confocale invertito e utilizzare il laser a 405 nanometri con una potenza laser del 70%, 100 iterazioni e una velocità di scansione di quattro per fotolibrare la maggior parte della fluorescenza cellulare dal gene elettroplaccato in una varietà di punti di tempo. Continuare a incubare gli embrioni sul palco a 36 gradi Celsius dopo lo sbiancamento delle foto, facendo attenzione alle cellule che dividono attivamente all'interno della regione fotolibrata che in genere si vedono solo in embrioni sani e quindi indicano che l'elettroporazione non ha danneggiato le cellule embrionali. Acquisire immagini Z-stack post-candeggina della regione elettroplaccata per un periodo di tempo desiderato a intervalli di tempo regolari da tre a cinque minuti.
Per garantire che le condizioni di imaging non influenzino in modo deleterio la sopravvivenza dell'embrione incubare simultaneamente embrioni elettroplaccati che non vengono fotoliciati per fungere da controllo per l'imaging. Per quantificare i risultati del fotobleaching per il decadimento dell'mRNA dopo l'elettroporazione utilizzare ImageJ per misurare l'intensità di fluorescenza di un cerchio di 7,5 micrometri al centro dell'area elettroplaccata di ogni cella per tracciare la fluorescenza cellulare su ogni intervallo da tre a cinque minuti. Quando tutte le cellule all'interno della regione fotolicellata che non sono sottoposte a mitosi e sono state completamente fotolicate sono state misurate, tracciare l'intensità della fluorescenza nel tempo dopo la candeggina in ciascuno dei punti di tempo in cui l'embrione è stato fotolicellato.
Sebbene l'elettroporazione del DNA porti ad una fluorescenza più luminosa in alcune cellule elettroplaccate, l'efficienza dell'elettroporazione del DNA è visibilmente inferiore rispetto alle proteine fluorescenti codificate con mRNA ampiamente espresse. Quando si confronta la co-elettroporazione di DNA e mRNA all'interno dello stesso embrione, il DNA che esprime l'efficienza delle proteine fluorescenti è anche significativamente e costantemente meno efficiente di quello dell'mRNA che esprime proteine fluorescenti. La quantificazione di tutti gli embrioni elettroplaccati con solo mRNA, DNA o una combinazione dei due, rivela che l'mRNA trasfetta circa il 75% delle cellule in una data regione, mentre il DNA trasfetta solo circa il 25% delle cellule.
L'mRNA trasfetto dovrebbe portare a una produzione proteica più veloce rispetto al DNA trasfetto poiché l'mRNA può essere immediatamente riconosciuto dai macchinari di traduzione citosolica. Sebbene la co-elettroporazione di più DNA si sia dimostrata in precedenza relativamente inefficiente, la co-elettroporazione di quattro mRNA in questo esperimento ha portato ad un'efficienza di trasfezione dell'87% di tutti e quattro gli mRNA in tutte le regioni elettroplaccate. Sebbene il fotobleaching inizialmente riduca l'intensità della fluorescenza nelle cellule fotolibrate di circa il 95%, rimangono alcune cellule che recuperano la loro capacità di dividere ed esprimere proteine fluorescenti poco dopo l'elettroporazione.
Questa abilità diminuisce tuttavia nell'oltre cinque ore dopo l'elettroporazione. Prenditi il tuo tempo per ottimizzare le migliori condizioni di imaging e continua a armeggiare anche dopo aver avviato il film essendo pronto ad apportare eventuali regolazioni, se necessario.
