Este ensayo in vitro demuestra la brotación angiogénica en una plataforma escalable y de alto rendimiento. Esto podría utilizarse para encontrar nuevos objetivos en la angiogénesis. Este ensayo de angiogénesis combina complejos microambientes celulares que incluyen gradientes y perfusión con una plataforma que es compatible con el cribado de alto rendimiento.
La angiogénesis desempeña un papel importante tanto en la salud como en la enfermedad. Comprender los mecanismos que se producen durante la angiogénesis podría ayudarnos a entender cómo crecen los cánceres y cómo se reparan los tejidos. Este método podría dar una idea de los mecanismos durante las enfermedades cardiovasculares y la regeneración tisular.
En ambos, la angiogénesis juega un papel importante. Para el primer uso de esta plataforma microfluídica, debe ser consciente de la ley de volúmenes y cómo pipetear. Puede confirmar los pasos mirando bajo un microscopio o volteando la placa al revés.
Algunos pasos son difíciles de hacerse una idea al leer el método, por ejemplo, cuán pequeños son los canales microfluídicos o cómo sostener la placa. Demostrar estos procedimientos estará Wendy Stam, una técnico de nuestro laboratorio. Para comenzar, transfiera la placa microfludica de 384 pozos a una campana de flujo laminar estéril.
Retire la tapa y agregue 50 microlitros de agua o solución salina tamponada de fosfato a cada uno de los 40 pozos de observación utilizando una pipeta multicanal. A continuación, añadir 1,5 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de colágeno una solución a la entrada de gel de cada unidad microfluídica. Asegúrese de que la gota de gel se coloca en el centro de cada pozo para que el gel entre en el canal.
Después de llenar cinco unidades microfluídicas, voltee la placa al revés para inspeccionar visualmente el llenado correcto de los canales de gel. Coloque la placa microfludida en una incubadora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos para polimerizar el colágeno uno. A continuación, saque la placa de la incubadora y transfiera a una campana de flujo laminar estéril.
Añadir 50 microlitros de 10 microgramos por mililitro de solución de codificación de fibronectina al pozo de salida del canal de perfusión superior de cada unidad microfluídica. Presione la punta de la pipeta contra el lado del pozo para el llenado correcto del pozo sin atrapar burbujas de aire. El canal se llena y las sartenes de líquido en la salida sin llenar bien la salida.
A continuación, coloque el plato en la incubadora durante al menos dos días. Ahora, descongele rápidamente los IPSC-ECs congelados durante menos de un minuto en un baño de agua Celsius de 37 grados. Luego transfiera las células a un tubo de 15 mililitros y agregue lentamente 10 mililitros de medio basal para diluir.
Dibuje 10 microlitros de la solución y cuente las células en un contador de celdas. Centrifugar el tubo a 100 g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante sin alterar el pellet celular y resuspend en medio basal para producir una concentración de dos veces 10 a las séptimas células por mililitro.
A continuación, transfiera la placa microfluídica de 384 pozos de la incubadora a una campana de flujo laminar estéril. Aspirar la solución de codificación de fibronectina de la salida de perfusión y añadir 25 microlitros de medio basal en los pozos de salida. Agregue una gota de microlitro de suspensión celular a cada pozo de entrada de perfusión superior.
La gota se aplana en unos segundos. Compruebe bajo un microscopio si la siembra es homogénea dentro de un solo canal y entre canales. Incubar la placa microfluídica del pozo durante una a 1,5 horas a 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono.
Después de eso, revise las células para confirmar que se han adherido. Retire el medio basal de los pozos de salida de perfusión superior. Agregue el medio de cultivo del recipiente caliente en la entrada y salida de perfusión superior.
Coloque la placa sobre una plataforma basculante que se establece en un ángulo de siete grados y ocho minutos de balanceo en la incubadora. En el primer y dos días después de la siembra, imagine la placa utilizando un microscopio Brightfield con etapa automatizada para confirmar la viabilidad celular. Después de dos días, se ha formado una monocapa confluente contra el colágeno un andamio.
En primer lugar, preparar 4,5 mililitros de medio de brotación angiogénica complementando 4,5 mililitros de medio basal con 4,5 microlitros de stock de VEGF, 4,5 microlitros de stock de PMA y 2,25 microlitros de stock S1P. Preparar 8,5 mililitros de medio de crecimiento de recipientes complementando el medio basal con 5,1 microlitros de VEGF y 3,4 microlitros de BFGF. Aspirar el medio de los pozos y añadir 50 microlitros de medio de cultivo de recipientes frescos en los pozos de entrada y salida de perfusión superior y los pozos de entrada y salida de gel.
A continuación, añada 50 microlitros de mezcla de brotes angiogénicos a cada uno de los pozos de entrada y salida del canal de perfusión inferior. Coloque la placa de nuevo en la incubadora en la plataforma del balancín para formar un gradiente de factores de crecimiento angiogénicos. Un día y dos días después de la adición de los factores de crecimiento angiogénicos, utilice un microscopio Brightfield para tomar imágenes de los pozos en una etapa automatizada.
Para estudiar la anastomosis y la estabilización de brotes, agregue un microlitro de 0,5 miligramos por mililitro de albúmina etiquetada fluorescentemente a la entrada de perfusión superior. A continuación, mezcle la solución con una pipeta de 50 microlitrotros. Transfiera la placa a un microscopio fluorescente con una etapa automatizada y una incubadora de 37 grados centígrados.
Ajuste el microscopio al objetivo 10X y corrija los ajustes de exposición. Adquiere imágenes timelapse cada minuto durante 10 minutos. Retire la placa del microscopio y transfiera la placa a una campana de flujo laminar estéril.
Retire todo el medio de los pozos y reemplace tanto el medio de cultivo del recipiente como el medio de brotación angiogénico en los pozos correspondientes. Vuelva a colocar la placa microfluídica en la incubadora para continuar con la brotación angiogénica. En el sexto día, repita la imagen para estudiar la permeabilidad.
Para arreglar el cultivo celular, aspirar todos los medios de cultivo de los pozos. Añadir 25 microlitros de 4%PFA en PBS a todos los pozos de entrada y salida de perfusión. A continuación, coloque un lado de la placa microfluídica en la tapa en un ligero ángulo de cinco grados para inducir el flujo.
Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de eso, aspirar la PFA de los pozos. Lave todas las entradas y salidas de perfusión dos veces con 50 microlitros de HBSS.
A continuación, aspirar el HBSS de los pozos. El paraformaldehído es un químico peligroso que debe manipularse con guantes y solo se abre en una campana de humos. A continuación, añada 50 microlitros de 0,2% de surfactante no iónico a todas las entradas y salidas de perfusión para permeabilidad a temperatura ambiente durante 10 minutos y coloque la placa microfluídica sobre la tapa en un ligero ángulo de cinco grados.
Aspirar el tensioactivo no iónico de los pozos y lavar los canales de perfusión dos veces añadiendo 50 microlitros de HBSS a todos los pozos de entrada y salida de perfusión. Aspirar el HBSS de los pozos. Prepare Hoechst 1,000 a 2,000 para manchar los núcleos y prepare Phalloidin 100 a 200 en HBSS para la tinción de F-actina.
Combine seis mililitros de HBSS, 30 microlitros de F-actina y tres microlitros de Hoechst en un tubo Falcon. A continuación, añada 25 microlitros a cada pozo de entrada y salida de perfusión. Coloque la placa bajo un ángulo ligero e incubar a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
Lavar dos veces con 50 microlitros de HBSS en todas las entradas y salidas de perfusión. A continuación, imagen directamente utilizando un microscopio fluorescente con etapa automatizada o almacenar la placa protegida de la luz a cuatro grados Celsius para su uso posterior. En este protocolo, los micro vasos se perfundían continuamente y se exponían a un gradiente de factores de crecimiento angiogénicos.
La siembra de los IPSC-CE mediante el método de bombeo pasivo dio lugar a densidades de siembra homogéneas. El timelapse de una gota que se coloca en la parte superior de la entrada del canal microfluídico muestra la gota justo después de la adición, la gota en la parte superior del tronco de entrada después de la adición, hasta que el menisco de gota fue fijado por la entrada que resultó en un flujo hacia la salida. La exposición a un gradiente de factores angiogénicos dio lugar a la brotación angiogénica direccional de los micro vasos dentro del colágeno modelado un gel.
La formación de células de punta clara y la invasión en el colágeno un gel fueron visibles 24 horas después de la adición del gradiente angiogénico, mientras que las células de la población, incluida la formación de lúmenes, eran visibles después de 48 horas. Después de la fijación y tinción, se identificó la forma y la longitud de estos brotes. Sin embargo, sin la adición de factores de crecimiento, no se observó ninguna invasión en el gel de colágeno uno.
Con imágenes confocales, se determinó el diámetro del brote y se confirmó la formación de lúmenes. Este método podría utilizarse para detectar nuevos inhibidores angiogénicos. Esto podría ayudar a encontrar nuevos tratamientos contra la retinopatía diabética, la artritis reumatoide y el cáncer.
Actualmente estamos explorando cómo podemos crear co-cultivos incluyendo un modelo de la barrera hematoencefálica y organoides vascularizados.
