Bu in vitro tsay yüksek iş ve ölçeklenebilir platformda anjiyojenik filizlenme gösterir. Bu anjiyogenezde yeni hedefler bulmak için kullanılabilir. Bu anjiyogenez tonu, degradeler ve perfüzyon içeren karmaşık hücresel mikro ortamları yüksek iş akışı taraması ile uyumlu bir platformla birleştirir.
Anjiyogenez hem sağlık hem de hastalıkta önemli bir rol oynar. Anjiyogenez sırasında ortaya çıkan mekanizmaları anlamak kanserlerin nasıl büyüdüğünü ve dokuların nasıl onardığını anlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem kardiyovasküler hastalıklar ve doku rejenerasyonu sırasında mekanizmaları fikir verebilir.
Her ikisinde de anjiyogenez önemli bir rol oynar. Bu mikroakışkan platformun ilk kez kullanımı için, hacimler yasası ve nasıl pipet farkında olmak gerekir. Adımları mikroskop altından bakarak veya tabağı ters çevirerek onaylayabilirsiniz.
Bazı adımlar sadece yöntemi okurken bir his almak zordur, örneğin mikroakışkan kanalların ne kadar küçük olduğu veya plakanın nasıl titretilecek. Bu prosedürleri gösteren Wendy Stam, laboratuarımızdan bir teknisyen olacak. Başlamak için, mikrofludic 384-iyi plaka steril laminar akış kaputuna aktarın.
Kapağı çıkarın ve çok kanallı pipet kullanarak 40 gözlem kuyularının her birine 50 mikrolitre su veya fosfat tamponlu tuz ekleyin. Sonra her mikroakışkan birimin jel girişine mililitre kollajen başına dört miligram 1.5 mikrolitre ekleyin. Jel damlacık kanal girmek için her kuyunun ortasına yerleştirilir emin olun.
Beş mikroakışkan üniteyi doldurduktan sonra, jel kanallarının doğru dolumlarını görsel olarak incelemek için plakayı ters çevirin. 37 santigrat derece ve kollajen bir polimerize için 10 dakika boyunca% 5 karbondioksit bir kuvöz mikrofludik plaka yerleştirin. Sonra kuvöz den plaka almak ve steril bir laminar akış kaputuna aktarın.
Her mikroakışkan birimin üst perfüzyon kanalının çıkış kuyusu için mililitre fibronektin kodlama çözeltisi başına 10 mikrolitre 50 mikrolitre ekleyin. Hava kabarcıklarını yakalamadan kuyunun doğru doldurulması için pipet ucunu kuyunun kenarına bastırın. Kanal doldurur ve priz de doldurmadan çıkış üzerinde sıvı tava.
Sonra en az iki gün boyunca kuvözde plaka yerleştirin. Şimdi, 37 derece santigrat su banyosunda donmuş IPSC-EC'leri bir dakikadan daha az bir süre için hızla eritin. Sonra hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve yavaş yavaş seyreltmek için bazal orta 10 mililitre ekleyin.
Çözeltinin 10 mikrolitresini çizin ve hücreleri bir hücre sayacının üzerinde sayın. Tüpü 100 kez g'de beş dakika santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin ve mililitrede yedinci hücrelere iki kat 10 konsantrasyon vermek için bazal ortamda yeniden askıya alın.
Daha sonra, mikroakışkan 384-iyi plakayı kuvözden steril laminar akış kaputuna aktarın. Perfüzyon çıkışından fibronektin kodlama çözeltisini aspire edin ve çıkış kuyularına 25 mikrolitre bazal ortam ekleyin. Her üst perfüzyon girişine bir mikrolitrelik hücre süspansiyonu damlatın.
Damlacık birkaç saniye içinde dümdüz olacak. Tohumlamanın tek bir kanal içinde ve kanallar arasında homojen olup olmadığını mikroskop altında kontrol edin. Mikroakışkan kuyu plakasını 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle 1 ila 1,5 saat kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, bağlı olduklarını doğrulamak için hücreleri kontrol edin. Bazal ortamı üst perfüzyon çıkış kuyularından çıkarın. Üst perfüzyon giriş ve çıkış sıcak damar kültür orta ekleyin.
Kuvözde yedi derecelik bir açı ve sekiz dakika sallanan aralıküzerine ayarlanmış bir rocker platform üzerinde plaka yerleştirin. Birinci ve ikinci tohumlama sonrası, hücre canlılığını doğrulamak için otomatik sahne ile brightfield mikroskobu kullanarak plaka görüntü. İki gün sonra, kollajen bir iskele karşı bir confluent monolayer oluşmuştur.
İlk olarak, 4.5 mililitre bazal orta ve VEGF stok, 4.5 mikrolitre PMA stok ve S1P stok 2.25 mikrolitre takviyesi ile anjiyojenik filizlenme orta 4.5 mililitre hazırlamak. 5.1 mikrolitre VEGF ve 3.4 mikrolitre BFGF ile bazal orta takviyesi ile 8.5 mililitre damar büyüme ortamı hazırlayın. Kuyulardan orta aspire ve üst perfüzyon giriş ve çıkış kuyuları ve jel giriş ve çıkış kuyuları taze damar kültürü orta 50 mikrolitre ekleyin.
Sonra alt perfüzyon kanal giriş ve çıkış kuyuları her 50 mikrolitre anjiyojenik filiz karışımı ekleyin. Anjiyojenik büyüme faktörlerinin bir gradyan oluşturmak için kaya platformunda kuvöz içine plaka geri yerleştirin. Anjiyojenik büyüme faktörlerinin eklenmesinden bir gün ve iki gün sonra, kuyuları otomatik bir sahnede görmek için Brightfield mikroskobu kullanın.
Anastomoz ve filiz stabilizasyonunu incelemek için, üst perfüzyon girişine mililitre floresan etiketli albumin başına bir mikrolitre 0,5 miligram ekleyin. Daha sonra çözeltiyi 50 mikrolitrelik pipetle karıştırın. Plakayı 37 santigrat derece otomatik sahne ve kuluçka makinesi ile floresan mikroskoba aktarın.
Mikroskobu 10X hedefine ayarlayın ve pozlama ayarlarını düzeltin. 10 dakika boyunca her dakika zaman atlamalı görüntüler elde edin. Plakayı mikroskoptan çıkarın ve tabağı steril laminar akış başlığına aktarın.
Kuyulardan tüm orta çıkarın ve ilgili kuyularda hem damar kültürü orta ve anjiyojenik filizlenme orta değiştirin. Anjiyojenik filizlenme devam etmek için geri kuvöz içine mikroakışkan plaka yerleştirin. Altıncı günde, geçirgenliği incelemek için görüntülemeyi tekrarlayın.
Hücre kültürünü düzeltmek için, kuyulardan tüm kültür medyaaspire. Tüm perfüzyon giriş ve çıkış kuyularına PBS'de %4 PFA'dan 25 mikrolitre ekleyin. Daha sonra mikroakışkan plakanın bir tarafını kapağın üzerine beş derecelik hafif bir açıyla yerleştirin ve akışı nasibe edin.
Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat. Bundan sonra, kuyulardan PFA aspire. Tüm perfüzyon girişlerini ve prizlerini 50 mikrolitre HBSS ile iki kez yıkayın.
Sonra hbss kuyulardan aspire. Paraformaldehit eldiven giyerek ele alınması gereken ve sadece bir duman başlık açıldı tehlikeli bir kimyasaldır. Daha sonra, tüm perfüzyon giriş ve çıkışları için 10 dakika oda sıcaklığında permeabilize ve beş derece hafif bir açıyla kapak mikroakışkan plaka yerleştirmek için% 0.2 non-iyonik yüzey aktif 50 mikrolitre ekleyin.
Tüm perfüzyon giriş ve çıkış kuyularına 50 mikrolitre HBSS ekleyerek, kuyulardan iyonik olmayan yüzey aktif maddeyi aspire edin ve perfüzyon kanallarını iki kez yıkayın. HBSS'yi kuyulardan aspire edin. Çekirdekleri boyamak için Hoechst 1, 000-2,000'i hazırlayın ve Phalloidin'i HBSS'de F-aktin boyamaiçin 100 ila 200 arasında hazırlayın.
Altı mililitre HBSS, 30 mikrolitre F-aktin ve falcon tüpünde üç mikrolitre Hoechst'i birleştirin. Sonra her perfüzyon giriş ve çıkış iyi 25 mikrolitre ekleyin. Plakayı hafif bir açıya yerleştirin ve en az 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
Tüm perfüzyon girişlerinde ve çıkışlarında 50 mikrolitre HBSS ile iki kez yıkayın. Daha sonra otomatik sahne ile bir floresan mikroskop kullanarak doğrudan görüntü veya daha sonra kullanmak için dört santigrat derece ışıktan korunan plaka saklayın. Bu protokolde mikro damarlar sürekli olarak perfüzyona maruz kalmış ve anjiyojenik büyüme faktörlerinin gradyanlarına maruz kalmıştır.
PASIF pompalama yöntemi kullanılarak IPSC-EC'lerin tohumlanması homojen tohumlama yoğunlukları ile sonuçlandı. Mikroakışkan kanalın girişinin üstüne yerleştirilen bir damlacık timelapse ekleme den hemen sonra damlacık gösterir, eklemeden sonra giriş gövdesinin üstüne damlacık, damlacık menisküs çıkış doğru bir akış ile sonuçlanan giriş tarafından pinned kadar. Anjiyojenik faktörlerin bir gradyan maruz kalma desenli kollajen bir jel içinde mikro damarların yönlü anjiyojenik filizlenme ile sonuçlandı.
Berrak uç hücre oluşumu ve kollajen içine invazyon bir jel anjiyojenik gradyan eklenmesinden 24 saat sonra görünür iken lümen oluşumu dahil stok hücreleri 48 saat sonra görülebilir. Fiksasyon ve boyama dan sonra bu filizlerin şekli ve uzunluğu belirlendi. Ancak, büyüme faktörleri nin eklenmesi olmadan, kollajen içine hiçbir invazyon bir jel gözlendi.
Konfokal görüntüleme ile filiz çapı belirlendi ve lümen oluşumu doğrulandı. Bu yöntem yeni anjiyojenik inhibitörleri taramak için kullanılabilir. Bu diyabetik retinopati karşı yeni tedaviler bulmak için yardımcı olabilir, romatoid artrit ve kanser.
Şu anda kan-beyin bariyeri ve vaskülarize organoidler bir model de dahil olmak üzere ortak kültürler ilerleyebilir nasıl araştırıyoruz.
