Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regulación genética, ya que permite el descubrimiento del promotor principal y potenciador utilizando cantidades bajas de material de partida. La principal ventaja de esta técnica es que permite un mapeo imparcial de resolución de nucleótido único en todo el genoma de los sitios de inicio transcripcional de ARN polimerasa II utilizando sólo 10 nanogramos de ARN total. CAGE está demostrando ser invaluable para descubrir sitios de inicio de transcripción asociados a la enfermedad que se pueden utilizar como marcadores de diagnóstico.
SLIC-CAGE extiende estos descubrimientos para escalar muestras como biopsias de tejido. SLIC-CAGE es ideal para el análisis promotor en profundidad y de alta resolución de tipos de células frágiles, incluidas las primeras etapas del desarrollo embrionario o el tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo. Dado que hay numerosos pasos en este protocolo, es crucial minimizar la pérdida de muestra en cada paso teniendo cuidado de recuperar tanto material como sea posible al transferir entre tubos.
Comience preparando la mezcla de PCR para cada plantilla. Combine buffer, dNTP, imprimación delantera única, plásmido de plantilla con el gen portador sintético y polimerasa de fusión de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Mezclar los reactivos por pipeteo.
Agregue 90 microlitros de la mezcla de PCR a 10 microlitros de cada imprimación inversa y mezcle. Consulte el manuscrito para conocer las condiciones de termociclismo. Realice la transcripción inversa o RT en el ARN de interés.
Combine un microlitro de imprimación de transcripción inversa, 10 nanogramos de ARN y 4. 990 nanogramos de mezcla portadora en un volumen total de 10 microlitros. Mezclar en pipeteando arriba y abajo. Calienta la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego colóquela inmediatamente sobre hielo.
Preparar la mezcla RT de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y añadir 28 microlitros de la mezcla a 10 microlitros de ARN. Mezclar el contenido del tubo pipeteando hasta que sea homogéneo. Ejecute RT en un termociclador.
Una vez completada la transcripción inversa, purifique el producto con cuentas magnéticas SPRI libres de DNase y RNase. Agregue las perlas a la mezcla RT en una relación de volumen de 1.8 a uno y mezcle bien por pipeteo. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Luego, coloca las cuentas en un soporte magnético y deja que se separen durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y agregue 200 microlitros de 70% de etanol recién preparado a las perlas. No mezcle las perlas ni las quite del soporte magnético y retire el etanol inmediatamente después de añadirlo.
Mantenga el tubo en el soporte magnético y retire todos los rastros de etanol empujando las gotas restantes hacia fuera con una pipeta P10. Agregue inmediatamente 42 microlitros de agua, y pipetee hacia arriba y hacia abajo 60 veces para eluir la muestra, teniendo cuidado de no causar espuma. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante cinco minutos sin la tapa y luego separar las perlas en el soporte magnético.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos, teniendo cuidado de recuperar todo el sobrenadante, pero evitar el traspaso de cuentas. Después del tratamiento con RNase I, mezcle 45 microlitros de muestra con 105 microlitros de cuentas de estreptavidina preparadas e incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, pipetear la muestra cada 10 minutos para mezclar.
A continuación, separe las perlas en el soporte magnético y retire el sobrenadante. Lave las perlas con los buffers A, B y C.A partir del buffer A, resuspender las perlas en 150 microlitros de tampón. Separe en el soporte magnético durante dos o tres minutos, y luego retire el sobrenadante.
Precaliente los tampones B y C a 37 grados Centígrados y repita los pasos de lavado. Para eliminar todo el ARN sin tapar, es crucial lavar a fondo las perlas de estreptavidina y las paredes del tubo y eliminar completamente el tampón de lavado antes de agregar el siguiente. Para liberar el ADNc, resuspender las perlas en 35 microlitros de 1X RNase I buffer e incubar a 95 grados Celsius durante cinco minutos.
Después de la incubación, coloque inmediatamente las cuentas sobre hielo durante dos minutos. Separe las perlas en un soporte magnético y transfiera el sobrenadante a un nuevo conjunto de tubos. Resuspender las perlas en 30 microlitros de 1X RNase I buffer y luego separar en un soporte magnético.
Combine el sobrenadante con el sobrenadante previamente recogido para un volumen total de aproximadamente 65 microlitros. Realice qPCR para determinar el número de ciclos de PCR para la amplificación de la biblioteca de destino. Prepare las mezclas maestras qPCR para amplificar bibliotecas enteras de ADN del portador.
Establezca las condiciones de termociclismo de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y amplíe la muestra preparada. El protocolo SLIC-CAGE permite obtener bibliotecas listas para la secuenciación a partir de nanogramos de material de ARN de arranque. La longitud del fragmento en la biblioteca final oscila entre 200 y 2.000 pares base.
Los fragmentos más cortos son artefactos PCR y pueden causar problemas de secuenciación en la línea. Se pueden realizar rondas adicionales de selección de tamaño para eliminarlas. En comparación con NanoCAGE, SLIC-CAGE exhibe un rendimiento significativamente mejor en la identificación del sitio de inicio de transcripción, lo que es evidente a partir de las curvas características de funcionamiento del receptor de las dos técnicas realizadas en varias cantidades de ARN total de S.cerevisiae.
Al realizar este protocolo, es importante tener en cuenta que la pérdida de muestra puede dar lugar a bibliotecas de baja complejidad. Para evitarlo, se deben utilizar puntas y tubos de pipeta de baja unión. Sin SLIC-CAGE, el análisis promotor de varios tipos de células ha sido hasta ahora inaccesible.
Esto incluye el análisis de las etapas del desarrollo embrionario o tejido embrionario de una amplia gama de organismos modelo.
