El objetivo de los ensayos de un híbrido de levadura mejorada es identificar el conjunto de factores de transcripción que se unen a una secuencia de ADN de interés. La ventaja de esta técnica es que los ensayos de un solo híbrido de levadura mejorada pueden evaluar más de 1000 factores de transcripción en un solo experimento. Por el contrario, la inmunoprecipitación de cromatina evalúa solo un factor de transcripción a la vez.
Este método constituye una herramienta clave para la genómica funcional para identificar el repertorio de factores de transcripción que se unen a los promotores y potenciadores de genes e identificar factores de transcripción alterados que se unen a variantes no codificantes. Demostrando el procedimiento será el Dr.Xing Liu un postdoctorado de mi laboratorio. Descongelar las placas de glicerol de levadura con la matriz de presas TF sobre hielo.
Resuspender la levadura con una pipeta de 12 canales y proceder al siguiente paso dentro de 1 a 3 minutos. Para detectar la levadura en sc menos placas rectangulares de triptófano, utilice un robot de matriz de alta densidad para seleccionar múltiples 96 placas como la fuente, 96 placas de agar como el objetivo, y 96 almohadillas de pasador largo. Las almohadillas de pasador no son reutilizables y deben desecharse.
Seleccione el programa Spot Many para hacer dos copias por cada placa de 96 pozos. No utilice las opciones de reciclaje o revisión para evitar la contaminación posterior de las poblaciones congeladas. Además, seleccione la opción de girar hacia arriba y hacia abajo en la fuente para mezclar la levadura.
Siga las instrucciones para dónde y cuándo colocar las placas y permita que el robot detecte la levadura en placas rectangulares Sc menos triptófano. Embolse la matriz manchada e incuba su lado del agar a 30 grados Centígrados durante 2 a 3 días. Para generar 384 matrices de colonias en Sc menos placas rectangulares de triptófano, seleccione 96 placas de agar como fuente, 384 placas de agar como objetivo y 96 almohadillas de pasador cortas.
A continuación, seleccione el programa de origen único de la matriz 1:4. De esta manera, cuatro placas de colonia 96 se consolidarán en una placa de colonia 384. No utilice las opciones de reciclaje o revisión para evitar la contaminación entre diferentes placas.
Embolsa las placas e incuba el agar de matriz de 384 colonias manchado a 30 grados Celsius durante 2 días. Para generar 1536 matrices de colonias en Sc menos placas rectangulares de triptófano, seleccione 384 placas de agar como fuente, las 1536 placas de agar como el objetivo, y 384 almohadillas de pasador cortas. A continuación, seleccione el programa de código fuente único del ensayo 1:4.
El objetivo es copiar cada colonia en cuatro colonias para obtener cuadrúplicas. Utilice las opciones de reciclaje y revisión, ya que esto implica copiar cada colonia 4 veces. Siga las instrucciones del robot y permita que el robot detecte la levadura en las placas antes de embolsarse e incubar el lado del agar de la matriz de colonias 1536 manchado hacia arriba a 30 grados Celsius durante 3 días.
Para amplificar la matriz de colonias 1536 en placas rectangulares Sc menos triptófano, seleccione 1536 placas de agar como fuente, 1536 placas de agar como objetivo y 1536 almohadillas cortas de pasador. Seleccione el programa Replicar muchos para replicar de 3 a 4 copias. Utilice la opción de reciclaje y revisión, pero tire la almohadilla cuando cambie a una placa diferente de la matriz para evitar la contaminación cruzada.
Permita que el robot amplificar la matriz de colonias 1536 en Sc menos placas rectangulares de triptófano. Finalmente, embolse las placas e incuba el agar de matriz de colonias manchado de lado a 30 grados Celsius durante 3 días para usar para los pasos de apareamiento. Para preparar el césped de cepa de cebo de ADN para el apareamiento, detectar las cepas de cebo de levadura de ADN en un Sc menos uraci y placa de histidina y crecer durante 3 días a 30 grados Celsius.
Rayar la levadura en un 15 centímetros Sc menos uraci y placa de histidina utilizando un palillo de dientes estéril para que cada plato se ajuste a 12 a 16 cepas diferentes. Incubar la placa un día a 30 grados centígrados. Al día siguiente, raya la levadura en un Sc menos 15 centímetros y una placa de histidina usando un palillo de dientes estéril para que cada plato se adapte a 4 cepas diferentes.
Incubar la placa durante un día a 30 grados centígrados. Después de la incubación, raspar la levadura usando un palillo de dientes estéril, asegurándose de no raspar ningún agar. Añadir la levadura en un tubo de 1,5 mililitros con 500 microlitros de agua estéril.
Ahora agregue de 10 a 15 perlas de vidrio estériles y la suspensión de levadura en una placa rectangular YAPD. Agitar bien en todas las direcciones durante un minuto para asegurar que la levadura se extiende por todo el plato. Invierta la placa inmediatamente y toque para que las perlas vayan a la tapa.
Retire y recicle las cuentas. Embolse los platos e incuba el lado del agar durante 1 a 2 días a 30 grados centígrados. A continuación, continúe con el paso de acoplamiento.
Para acoplar el cebo de ADN de levadura y las cepas de matriz TF, transfiera la matriz TF a una placa rectangular YAPD con el robot. Seleccione la placa de agar 1536 como la fuente y el objetivo, y la almohadilla de pasador corto 1536. Seleccione el programa Replicar muchos.
Seleccione 4 placas de origen y las opciones de reciclaje y revisión. Cada placa de matriz TF se puede utilizar para transferir de 3 a 4 placas YAPD. Las placas de matriz TF utilizadas para el acoplamiento deben tener de 2 a 3 días, pero no más, ya que el acoplamiento puede ser ineficiente.
Para transferir el césped de una cepa de cebo de ADN a las placas YAPD que ya contienen la matriz TF, seleccione la placa de agar 1536 como la fuente y el objetivo y la almohadilla de pin corto 1536. Seleccione el programa Replicar muchos. Utilice un desplazamiento aleatorio en la fuente con un radio de aproximadamente 0,6 milímetros para evitar tomar levadura del mismo lugar y seleccione Mezclar en blanco para facilitar el contacto entre las cepas de levadura.
Utilice el césped que contiene las cepas de cebo de ADN como fuente, y las placas YAPD que contienen la matriz TF manchada como el objetivo antes de embolsar las placas e incubarlas lado del agar a 30 grados Celsius durante un día. Para seleccionar la levadura diploide, seleccione la placa de agar 1536 como fuente y el objetivo, y seleccione la almohadilla de pasador corto 1536. Seleccione el programa Replicar.
Seleccione Mezclar en origen y en destino. Permita que el robot transfiera la levadura apareada de las placas YAPD a las placas Sc menos uraci y triptófano antes de embolsar las placas e incubarlas de lado del agar a 30 grados celsius durante 2 a 3 días. Ahora, seleccione las placas de agar 1536 como la fuente y el objetivo y la almohadilla de pasador corto 1536.
Seleccione el programa Replicar. Transfiera la levadura diploide de las placas Sc menos uracilo y triptófano a las placas rectangulares de lectura 3-AT y X-gal utilizando el robot. Embolsa los platos e incuba los agar a 30 grados centígrados durante un máximo de 7 días.
Para cepas de cebo de ADN con actividad de reportero de alto fondo, tome fotografías en los días 2, 3 y 4. De lo contrario, tome fotos en los días 4 y 7. Mantenga las placas de la matriz TF a temperatura ambiente y vuelva a copiarlas después de 7 días para una nueva ronda de cribado.
Para ilustrar el tipo de resultados que se pueden obtener utilizando ensayos de un solo híbrido de levadura mejorada, las regiones promotoras de los genes CCL15 e IL17F se analizaron contra una serie de 1086 TF humanos. El promotor CCL15 es un ejemplo de un cebo de ADN no automático, donde las interacciones, incluso las débiles, se pueden detectar fácilmente. El promotor IL17F es un ejemplo de un cebo de ADN autoactivo con actividad desigual de reportero de fondo donde se pueden detectar algunas interacciones, mientras que para varios TF, no se sabe si la actividad del reportero es mayor que el fondo.
Hay varios problemas que pueden ocurrir al realizar ensayos mejorados de levadura de un solo híbrido. En este caso, las colonias son demasiado pequeñas y no se pueden transferir. Típicamente, aproximadamente el 95% de las colonias de presas TF muestran un crecimiento normal.
En este ejemplo, no hay crecimiento de levadura en una porción del plato. Este problema está generalmente relacionado con un fallo en el paso de acoplamiento si la almohadilla de 1536 pines no logra hacer contacto con la levadura en el césped de deformación unión de cebo de ADN, en la matriz TF o en la placa de acoplamiento. En estos dos ejemplos, no se detecta ninguna interacción.
Este problema a menudo está relacionado con mutaciones inactivadoras involuntarias en los genes del reportero, en particular LacZ, o con una autoactividad demasiado alta que enmascara las interacciones. En este caso, la placa presenta manchas azules aleatorias que a menudo están relacionadas con la contaminación bacteriana. Lo más importante a tener en cuenta es la preparación adecuada de la placa.
Asegurarse de que todos los componentes se agregan y que la altura del agar es uniforme, ya que todos los pasos posteriores dependen de esto. Aunque la mayoría de los reactivos no son peligrosos, es importante usar guantes en todo momento para evitar la contaminación de las muestras y placas. Al igual que con cualquier ensayo de unión al ADN, es importante validar las interacciones identificadas mediante ensayos funcionales como ensayos de reporteros, derribos del factor de transcripción o nocaut, seguidos de la expresión de medición del gen objetivo.
Este método ha permitido la identificación de factores de transcripción que regulan los genes implicados en determinados procesos biológicos, así como factores de transcripción con unión alternativa a variantes asociadas a enfermedades no codificantes.
