Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da regulação genética, pois permite a descoberta do promotor principal e do aprimoramento usando baixas quantidades de material inicial. A principal vantagem desta técnica é que ela permite o mapeamento de resolução de nucleotídeos únicos, imparcial, em todo o genoma, dos locais de início transcricional RNA polymerase II usando apenas 10 nanogramas de RNA total. A CAGE está provando ser inestimável para descobrir locais de início de transcrição associados a doenças que podem ser usados como marcadores de diagnóstico.
O SLIC-CAGE estende essas descobertas para dimensionar amostras como biópsias teciduais. O SLIC-CAGE é ideal para análises de promotores aprofundados e de alta resolução de tipos de células frágeis, incluindo estágios de desenvolvimento embrionários precoces ou tecido embrionário de uma ampla gama de organismos modelo. Como existem inúmeros passos neste protocolo, é crucial minimizar a perda de amostras em cada passo, tomando o cuidado de recuperar o máximo de material possível ao transferir entre tubos.
Comece preparando o mix PCR para cada modelo. Combine buffer, dNTPs, primer avançado exclusivo, plasmídeo de modelo com o gene portador sintético e polimerase de fusão de acordo com as instruções do manuscrito. Misture os reagentes por pipeta.
Adicione 90 microliters da mistura PCR a 10 microliters de cada primer reverso e misture. Consulte o manuscrito para condições de termociclismo. Realize transcrição reversa ou RT no RNA de interesse.
Combine um microliter de primer de transcrição reversa, 10 nanogramas de RNA e 4.990 nanogramas de mistura de portador em um volume total de 10 microliters. Misture por pipetting para cima e para baixo. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e, em seguida, coloque-a imediatamente no gelo.
Prepare a mistura RT de acordo com as instruções do manuscrito e adicione 28 microliters da mistura a 10 microliters de RNA. Misture o conteúdo do tubo por pipeta até ficar homogêneo. Execute RT em um termociclador.
Uma vez concluída a transcrição reversa, purifique o produto com contas magnéticas SPRI livres de DNase e RNase. Adicione as contas ao mix RT a uma proporção de volume de 1,8 para uma e misture bem por pipetação. Deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por cinco minutos.
Em seguida, coloque as contas em um suporte magnético e deixe-as separadas por cinco minutos. Descarte o supernascer e adicione 200 microliters de 70% de etanol recém-preparado às contas. Não misture as contas ou retire-as do suporte magnético e remova o etanol imediatamente após a adição.
Mantenha o tubo no suporte magnético e remova todos os traços de etanol empurrando quaisquer gotículas restantes para fora com uma pipeta P10. Adicione imediatamente 42 microliters de água, e pipeta para cima e para baixo 60 vezes à amostra elute, tomando cuidado para não causar espuma. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por cinco minutos sem a tampa e, em seguida, separar as contas no suporte magnético.
Em seguida, transfira o supernatante para um novo conjunto de tubos, tomando o cuidado de recuperar todos os supernasais, mas evitar a transferência de contas. Após o tratamento RNase I, misture 45 microlitadores de amostra com 105 microliters de contas de streptavidina preparadas e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante a incubação, pipete a amostra a cada 10 minutos para misturar.
Em seguida, separe as contas no suporte magnético e remova o supernatante. Lave as contas com tampões A, B e C.Começando com tampão A, resuspense as contas em 150 microliters de buffer. Separe no suporte magnético por dois a três minutos e, em seguida, remova o supernatante.
Pré-aqueça os buffers B e C a 37 graus Celsius e repita os passos de lavagem. Para remover todo o RNA não tampado, é crucial lavar completamente as contas de streptavidina e as paredes do tubo e remover completamente o tampão de lavagem antes de adicionar o próximo. Para liberar o cDNA, resuspenque as contas em 35 microliters de tampão 1X RNase I e incubar a 95 graus Celsius por cinco minutos.
Após a incubação, coloque imediatamente as contas no gelo por dois minutos. Separe as contas em um suporte magnético e transfira o supernatante para um novo conjunto de tubos. Resuspenque as contas em 30 microliters de tampão 1X RNase I e, em seguida, separe em um suporte magnético.
Combine o supernatante com o supernascer previamente coletado para um volume total de cerca de 65 microliters. Execute qPCR para determinar o número de ciclos PCR para amplificação da biblioteca de destino. Prepare as misturas mestres qPCR para amplificar bibliotecas inteiras de DNA do portador.
Defina condições de termociclismo de acordo com as instruções do manuscrito e amplie a amostra preparada. O protocolo SLIC-CAGE permite obter bibliotecas prontas para sequenciamento a partir de nanogramas de material RNA inicial. O comprimento do fragmento na biblioteca final varia entre 200 e 2.000 pares de base.
Fragmentos mais curtos são artefatos PCR e podem causar problemas de sequenciamento na linha. Rodadas adicionais de seleção de tamanho podem ser realizadas para removê-las. Em comparação com o NanoCAGE, o SLIC-CAGE apresenta um desempenho significativamente melhor na identificação do local de início da transcrição, o que é evidente a partir das curvas características operacionais do receptor das duas técnicas realizadas em várias quantidades de RNA total S.cerevisiae.
Ao executar este protocolo, é importante ter em mente que a perda de amostras pode levar a bibliotecas de baixa complexidade. Para evitar isso, devem ser utilizadas pontas e tubos de pipeta de baixa ligação. Sem o SLIC-CAGE, a análise do promotor de vários tipos de células até agora tem sido inacessível.
Isso inclui a análise de estágios embrionários de desenvolvimento ou tecido embrionário de uma ampla gama de organismos modelo.
