Este protocolo es significativo porque se puede utilizar para interrogar los repertorios inmunes de los donantes humanos para identificar células B raras y específicas del antígeno. Esta técnica nos permite obtener cadenas pesadas y ligeras emparejadas de forma nativa, que pueden ser clonadas rápidamente, y luego probadas directamente contra el antígeno o antígenos de interés. Demostrando el procedimiento estará Mike Morton, un técnico de nuestro laboratorio.
Al menos una hora después de la descongelación y la recuperación, recoger el DONANTE PBMC por centrifugación. Y vuelva a suspender las células en 50 mililitros de mes Tampón de MES helado para contar. Pelecila las células por otra centrifugación, y aísle las células B positivas del CD22 por selección positiva con microperlas CD22 de acuerdo con los protocolos estándar.
Recoger las células CD22 positivas aisladas del cordón por centrifugación y resuspend las células a cuatro veces 10 a las séptimas células por mililitro de concentración de tampón de Vax. Agregue un cóctel de anticuerpos IgG CD19 CD27 a las células de acuerdo con las recomendaciones de dilución del fabricante con mezcla suave, y aliquot 10 a las células séptimas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para el control negativo. Añadir un tetraceros de steptavidina de biotina de doble etiqueta al tubo de control negativo a una concentración final de 36 nanomolares cada uno con un PE y APC, multiplicado por el número de péptidos en el tubo de clasificación.
Traiga el volumen final en cada tubo 2.5 mililitros con tampón Vax fresco y agregue los tetrámeros de péptidos a la clasificación de tubos a 36 nanomolares cada PE y APC. Después de centrifugar, llevar las células a dos veces 10 a la 6a por cada 100 microlitros de concentración de TBS para una incubación de 30 a 60 minutos, en la oscuridad, a cuatro grados centígrados, con rotación. Al final de la incubación, lave las células dos veces en tampón de TBS fresco por lavado antes de colar las muestras en tubos individuales de cinco mililitros de tapón de filtro.
Permar las muestras con una concentración final de 0,3 micromolares de DAPI como marcador de integridad de la membrana celular. Y ejecute todo el control negativo en el clasificador de celdas para establecer las puertas de citometría de flujo para aislar las poblaciones de celdas adecuadas para la clasificación de una sola célula. Trazar el antígeno PE versus antígeno APC y establecer la puerta R8 como un antígeno PE positivo, y APC-positivo cuadrante con un bajo número de eventos en la puerta doble positiva.
A continuación, clasif sino el antígeno CD19 positivo27 positivo PE positivo, células aPC positivas en pozos individuales de una placa de 96 pozos preparadas para Master Mix. Al final de la clase, cubra la placa con almohadillas de cinta de aluminio y centrifugar las celdas durante un minuto a 400 veces g antes de un almacenamiento de menos 80 grados. Para realizar una reacción de transcriptasa inversa, descongele las células B ordenadas sobre hielo durante dos minutos antes de girar la placa durante dos minutos a 3300 veces g para tirar del contenido del pozo hasta la parte inferior de la placa antes de abrirla.
Después de tratar las células con una enzima adecuada Master Mix, agregue 2,5 microlitros de ADN complementario como plantilla para cada reacción de PCR, y agregue imprimaciones a una concentración final de 1 micromolar a cada reacción. A continuación, agregue una concentración 2X de tampón de 10X de polimerasa a cada pozo para llevar el volumen final a 25 microlitros por reacción. Y ejecutar las reacciones PCR de cadena pesada y ligera cada uno durante 50 ciclos.
Al final de las reacciones, ejecuta las muestras en gel de 1% de agarosa para visualizar los impactos positivos de amplificación. Aísle las reacciones en cadena pesadas y ligeras emparejadas de la misma célula a través de la extracción de gel. Determinar la concentración del fragmento de ADN por la densidad óptica a 60 para cálculos precisos de la mezcla de ligadura.
Combine los fragmentos recuperados de cadena pesada y ligera con un fragmento de eslabón y la columna vertebral del vector de expresión utilizando una reacción de ligadura de cuatro fragmentos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y transformar las reacciones de ligadura en bacterias químicamente competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez chapado en placas antibióticas, añadir cuatro mililitros de medio de crecimiento con antibióticos al cultivo de transformación restante para la incubación durante la noche a 37 grados Celsius a 250 rotaciones por minuto.
A la mañana siguiente, preparar un ADN miniprep de los cultivos de mezcla de ligadura durante la noche de acuerdo con las instrucciones del fabricante y determinar la concentración de ADN plásmido resultante. Para confirmar la especificidad del antígeno de los anticuerpos aislados, transfeque 10 microgramos del ADN miniprep con reactivo de base lipídica catiónica en una suspensión de 10 mililitros de 293 células. Incubar el cultivo celular de tres a cuatro días a 37 grados centígrados y 8% de dióxido de carbono y 125 rotaciones por minuto.
Al final de la incubación, centrifugar el cultivo durante 10 minutos a 1000 veces g, y recuperar el medio clarificado. Mida la concentración de IgG en el sobrenadante a través de la afinidad con la proteína A y pruebe cada anticuerpo en el sobrenadante a una concentración de 25 microgramos por mililitro por ELISA frente a los péptidos individuales utilizados para la clasificación de acuerdo con los protocolos ELISA estándar. A continuación, confirme los golpes positivos de la pantalla con un ELISA adicional utilizando diluciones de IgG sobrenadante para generar una curva de concentración a partir de 20 microlitros por mililitro y trazando contra la densidad óptica de cada antígeno mostrando reactividad a la pantalla inicial ELISA.
Para aislar anticuerpos específicos de antígenos de donantes humanos, se pueden idear una serie de compuertas de citometría para aislar las células B de memoria objetivo. Los linfocitos se aíslan en función de su tamaño celular y granularidad, utilizando la dispersión hacia adelante y hacia el lado. Tras la exclusión de los dobletes y las células muertas, los marcadores fenotípicos permiten la segregación de células B CD19 positivas igG y células B de memoria CD27 positiva.
La primera lectura de la clonación de una sola célula es una confirmación de amplificación de las respectivas cadenas variables pesadas y ligeras. Aquí, un ejemplo de una amplificación muy eficiente de 24 células individuales con una recuperación emparejada del 42% después de que se muestre la PCR. Después de la clonación de IgG, el vector de expresión IgG se transpected en células del riñón embrionario humano 293.
Los anticuerpos recuperados se examinan contra el panel original de péptidos Tau puntuados para la reactividad por ELISA. A continuación, se completa una confirmación adicional utilizando una curva de concentración de las mismas muestras de anticuerpos recombinantes contra los péptidos identificados en la pantalla inicial. Por cada golpe positivo, un clon de plásmido individual puede aislarse de la piscina transformada y reconfirmarse mediante el mismo método ELISA.
El objetivo son las secuencias de amplificación de células individuales, por lo que lo más importante a recordar es que cualquier contaminación se amplificará durante la parte de PCR de este procedimiento. Este procedimiento produce anticuerpos recombinantes humanos intactos, lo que permite la purificación y caracterización funcional de tanto anticuerpo como desee generar.
