Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional del Cáncer R00 CA132784) a KT

1. Aislamiento de células mononucleares de sangre de cordón umbilical <ol><li> Preparar el tampón PBS-EDTA-añadir 5 ml de albúmina de suero bovino (BSA) solución madre a 95 ml de tampón de lavado (1:20 dilución). Desgasificar el tampón y mantener el búfer en hielo IMPORTANTE:. Si no se desgasificar el tampón puede resultar en resultados menos que óptimos cuando se aísla CD19 + células B porque las burbujas puede bloquear la columna de aislamiento. </li><li> Preparar tubos cónicos de 50 ml por centrifugación en gradiente de densidad. Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la sangre del cordón umbilical (1 tubo puede procesar 8 ml de sangre) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS a cada tubo. </li><li> Diluir 8 ml de sangre de cordón con 24 ml de DPBS (1x) y cuidadosamente la capa de la mezcla diluida de sangre de cordón en la parte superior de la Ficoll-Paque PLUS en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezcle la sangre y Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar la mezcla de la sangre del cordón umbilical y PLUS Ficoll-Paque, sostenga el tubo en un ángulo de 45 grados ycapa de la mezcla de sangre lentamente. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. Las células mononucleares (MNC) se mantendrá en el plasma-Ficoll-Paque PLUS interfaz mientras que los granulocitos y eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad a la presión osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta siete 5 ml de fondo redondo tubos para ser utilizados en la Parte 3 con el ID de la muestra, la fecha y la siguiente: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tubo </td><td> Etiqueta </td><td> Propósito </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sin teñir </td><td> Células no teñidas para la normalización durante la citometría de flujo </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Para determinar la viabilidad durante citometría de flujo </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Contiene las células que se según </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Para recoger CD34 + / CD19 +(Fines de pro-B - principios de pre-BI), las células </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Bajo 45 </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 bajo (pre-BI), las células </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 Med (pre-BII) las células </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 de alto </td><td> Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 alto (B) células inmaduras </td></tr></tbody></table> Escudo tubos 4, 5, 6, y 7 con FBS al 2% y colocar todos los tubos en hielo. <ol start="5"><li> Aspirar la capa superior de plasma cuidadosamente y evitar el contacto con la capa de células mononucleares. Usando una pipeta de 10 ml de vidrio, transferir cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Combinar las células mononucleares de tres tubos juntos en un tubo de 50 ml único. </li><li> Llenar el tubo con PBS, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Repita 1x. Después del primer lavado, resuspender los gránulos y transferir a un tubo de 50 ml único cónica. </li><li> Suavemente resuspender el sedimento celular en 200 ul de PBS. Eliminar 1 l de la suspensión de células, añadir a 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar de lado para contar (contar las células después de la colocación de la suspensión 50 ml de células en la centrífuga). Llenar el tubo con PBS y centrifugar a 200 xg durante 15 min para eliminar las plaquetas. Eliminar el sobrenadante completamente sin alterar el sedimento celular. </li></ol> 2. Modificado células B Aislamiento de células mononucleares utilizando separación MACS <ol><li> Resuspender el precipitado de la etapa 160 con 1,7 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. </li><li> Añadir 40 l B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina. Pipeta para mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células - añade 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células (células numbre determinado en el paso 1,7) y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante completamente y luego volver a suspender el sedimento celular en 320 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS. </li><li> Añadir 80 mu l anti-biotina MicroBeads, se mezcla bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células - añadir 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células y se centrifugan a 300 xg durante 10 min. Resuspender hasta 100 millones de células en 500 l de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS. Volumen de tampón de escala de acuerdo con el número de células. </li><li> Preparar columnas MACS y separadores MACS durante la centrifugación (Paso 2.5). Colocar una columna de LS en el campo magnético del separador MACS, añadir 3 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS en la columna y permitir que el tampón a gotear a través de la columna. Use un receptáculo para coger el flujo a través. Desechar el flujo a través. </li><li> Colocar un tubo cónico de 50 ml debajo de la columna y pipetear la suspensión celular en la columna. Permita que las células no marcadas a gotear through de la columna y en el tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas son las células que se utilizarán para el etiquetado de anticuerpos y de células de clasificación. No deseche el flujo a través. Para recuperar todas las células de la etapa 2,5, agregar un adicional de 1 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS a las paredes del tubo cónico. Mezclar suavemente y pipetear la suspensión celular restante en la columna. Repita 1x. Continúe en el paso 2,8 usando las células no marcadas recogidos en el tubo cónico después de pasar a través de la columna. </li><li> Llenar el tubo cónico que contenía las células no marcadas con PBS y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Añadir 200 l de EDTA-tampón PBS y suavemente resuspender las células. </li></ol> 3. Anticuerpo etiquetado y preparación para la clasificación de células <ol><li> Aspirar 1 l de la suspensión celular y el lugar en el tubo con la etiqueta &quot;sin mancha&quot; (paso 1,4). Añadir 500 l de EDTA tampón PBS y almacenar el tubo en hielo. </li><li> Añadir 20l de cada anticuerpo (CD19, CD34 y CD45) por millón de células en la suspensión celular restante. Mezclar bien y colocar el tubo en la oscuridad durante 30 min a TA. Anticuerpos CD son ligeros pasos delicados, completos 2-4 con las luces apagadas. </li><li> Después de 30 min de incubación con anticuerpos, aspire 40 l de la suspensión celular y colocarlo en el tubo etiquetado &quot;7AAD&quot;. Añadir 1 ml de PBS en el tubo y centrifugar a 500 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de tampón de unión. Añadir 7 l de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar en la oscuridad durante 10 min a TA. Durante la etapa de 10 min de incubación completa 3,4. </li><li> Añadir PBS a la parte superior del tubo que contiene las células que quedan marcadas con anticuerpos CD. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EDTA tampón PBS y resuspender el botón celular. Transferir todo el volumen de la suspensión de células en el tubo etiquetado &quot;+ + +&quot;. Para recuperar la totalidad de la suspensión de células add un adicional de 1 ml de EDTA tampón PBS al tubo cónico de 50 ml y la transferencia en el tubo marcado como &quot;+ + +&quot;. </li><li> Después de la incubación (paso 3.3), añadir 300 l de tampón de unión en el tubo 7AAD. El &quot;sin mancha&quot;, &quot;7AAD&quot; y &quot;+ + +&quot; muestras y el &quot;34 +&quot;, &quot;45 bajo&quot;, &quot;med 45&quot; y &quot;45&quot; tubos altos están listos para citometría de flujo. </li></ol> 4. Clasificación de células Utilizando el citómetro de flujo MoFlo XDP <ol><li> Set-up MoFlo para la clasificación: Alineación láser, chorro de gotitas estabilizar, determinar retraso gota. </li><li> Preparar los controles individuales de compensación de color utilizando Invitrogen AbC ratón talón kit (o similar) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecutar los controles de un solo color, ajustando las tensiones de canales de fluorescencia para la separación óptima de las poblaciones positivas y negativas. Establecer y aplicar los coeficientes de compensación parámetro compensa con el protocolo de recogida. Volver a establecer coeficientes de compensación cada vez que se obtiene un nuevo lote de anticuerpos. </li><li> Crear protocolo incluyendo parcelas como se muestra en la Figura 2. </li><li> Ejecutar muestra sin teñir, ajuste de voltaje y ganancia de dispersión frontal y lateral, e identificar las poblaciones negativas de fluorescencia. Debido a que la recuperación de ADN es el objetivo de la clase, el umbral debe establecerse bajo (≤ 1%), de modo que el ADN que contiene desechos no contamine las muestras recuperadas. * Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosol se está ejecutando en todo momento que viven las células humanas se están ejecutando en el MoFlo. </li><li> Ejecutar una pequeña alícuota de los + + + muestra (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia de puerta (Figura 2). Debido a que las células B progenitoras no dispersar de forma idéntica a las células B maduras, sin sincronización backgate el CD19 + / CD34 + población en el complot vs SSC FSC para asegurar la puerta de linfocitos incluye posibles células pro-B. De esta muestra también se establece la población fluorescencia negativa para 7AAD. </li><li> Ejecutar el ejemplo 7AAD para determinar la viabilidad de la muestra. Sólo las células de ordenación a partir de una muestra con alta viabilidad en laprincipio (≥ 95%) como células muertas se tiñen de manera indiscriminada y puede contaminar las poblaciones de ordenación. </li><li> Configure las decisiones de ordenación para recoger cuatro poblaciones: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 baja; CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto. Incluya los linfocitos y las puertas doblete discriminación en las decisiones de ordenación de todas las poblaciones. </li><li> Para evitar obstrucciones en la punta de la clasificación, el filtro + + + muestra a través de un filtro de 40 micras celda inmediatamente antes de la selección y volver a filtrar si cualquier agregación se produce en la muestra durante la clase. </li><li> Ordenar las células en tubos de recogida (paso 1,4) recubiertas con FBS al 2% en PBS en un soporte de tubo enfriada o hielo compactadas. </li><li> Inmediatamente después de la especie se ha completado, extraer el ADN. </li></ol>

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A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis.">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li><li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).</li><li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El factor con mayor impacto en el éxito del protocolo es la presencia de contaminación de los desechos. Si se solicita la sangre de un banco de sangre del cordón umbilical es importante tener la sangre enviada tan pronto después de la recogida como sea posible. Además, las muestras que se clasifican como linfocitosis contienen un mayor número de linfocitos, sin embargo, estas muestras no tienen un número suficiente de células B precursoras y no debe ser utilizado. Para aumentar la probabilidad de obtener un número suficiente de células para cada uno de los subconjuntos de precursores Recomendamos comenzar con al menos 85 ml de sangre del cordón umbilical. Es importante señalar que a diferencia de las separaciones de sangre periférica de adultos, cuando fraccionamiento de la sangre del cordón umbilical de la capa mononuclear menudo está contaminada con células rojas de la sangre 12. Este protocolo incluye una etapa de lavado adicional para eliminar las plaquetas contaminantes. Protocolos que describen las separaciones mononucleares de sangre de cordón sugiere incluir una etapa de lisis to eliminar los glóbulos rojos no deseados. No recomendamos este paso, ya que produce residuos contaminantes y tiene un impacto negativo en el éxito de la especie celular. Con el fin de reducir el número de células que tienen que ser distinguidos por citometría de flujo es necesario para llevar a cabo un enriquecimiento de células B antes de la clasificación de células. El protocolo proporcionado por Miltenyi Biotec, que acompaña el kit de aislamiento de células B (B-CLL), ha sido optimizado para la sangre periférica y recomienda el uso de 10 l B-CLL cóctel de anticuerpos biotina por 10 millones de células. Este paso utiliza anticuerpos contra CD2 (células T, células NK), células CD4 (células T), CD11b (granulocitos monocitos;; macrófagos), CD16 (células NK; macrófagos, mastocitos), CD36 (plaquetas), CD235a (células eritroides) para agotar las células no-B de la sangre del cordón umbilical. Es importante usar el kit descrito y no el de células B kit de aislamiento II debido a que el kit anterior contiene un anticuerpo contra CD43 que está presente en células pro-B. Durante nuestra optimización de este protocolo, se encontró que un total de 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina es suficiente para producir un resultado positivo tipo celular. Además se encontró que el uso de tan poco como 5 l más del cóctel de anticuerpos B-CLL biotina tuvieron efectos adversos en el tipo celular. Por lo tanto, es muy recomendable con 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina para el total de número de células mononucleares de entre 175-250 million. Si se comienza con números menores o mayores de las células puede ser necesario para escalar los reactivos en consecuencia. Hay numerosas publicaciones que describen las conflictivas marcadores que pueden ser utilizados para distinguir subpoblaciones de células B. La mayor parte de la discrepancia puede ser explicada por el hecho de que la diferenciación es un proceso continuo y que la presencia o ausencia de marcadores de superficie celular se produce de manera gradual en lugar de en forma de todo o nada. En este protocolo CD34 - / CD19 + y el nivel de intensidad de CD45 + (expresión bajo, medio, alto) fue utilizada para distinguir pre-BI, pre-BII e inmadura de células B con un aumento en el nivel de CD45 expresión correspondiente a la progresión de la diferenciación 6. Pro-células B han sido descritos por algunos como CD19 + / CD34 + 13 mientras que otros han demostrado que células pro-B son CD19 - / CD34 + y pre-BI células son CD19 + / CD34 + 9,10. Sobre la base de estas discrepancias se han designado las CD19 + / CD34 + células como fines pro-células B / principios de células pre-BI. Es importante señalar que esta estrategia se desarrolló para aislar los subconjuntos de precursor de células B que corresponden a las células afectadas por la enfermedad de la leucemia linfoblástica aguda. Sin embargo, existen múltiples estrategias de clasificación que se pueden emplear dependiendo del subtipo de células de interés. Anticuerpo-fluorocromo combinaciones deben ser seleccionados en base a las capacidades del clasificador de células disponibles. Como génerosl norma, la más brillante de fluorocromo en su panel debe utilizarse para marcar el antígeno menos poblado y viceversa. En la detección de doble manchadas de población, especialmente a los eventos raros como estos, la discriminación doblete (Figura 2B) es una parte muy importante de la estrategia de activación periódica. Esto garantiza que los eventos doble positivas son células verdaderamente individuales teñidas con los anticuerpos y no simplemente dos de una sola manchadas células adheridas entre sí. De alta velocidad, 4-way clasificación de células necesariamente crea un entorno controlado aerosol. Por lo tanto, la clasificación de células vivas humano debe realizarse con sumo cuidado. Publicado pautas de seguridad y descontaminación están disponibles y deben ser revisados ​​y aplicados antes de la clase 14. La aprobación de los Comités Institucionales de Bioseguridad o sus equivalentes puede ser requerido antes de la clasificación. Para la descontaminación adecuada después de la clasificación, la lejía debe añadirse al recipiente de desechos a una concentración final de 10%. Similarly, todos los tubos de muestras, así como todas las superficies en el área inmediata debe ser completamente descontaminado con una solución de lejía recién preparada 10%. En resumen, este protocolo proporciona una estrategia para la obtención de poblaciones raras de precursor de células B y puede ser modificado para aislar una población rara presente en la sangre del cordón incluyendo células madre hematopoyéticas y células T inmaduras. Recientemente, las células B inmaduras se han identificado en la sangre periférica de individuos con VIH avanzado 15. Por lo tanto, la utilidad de este método se extiende más allá del estudio de cánceres de la sangre. Por último, no se han realizado todavía aislamientos de ARN en las células de flujo según, sin embargo, este método debe ser adaptable con la salvedad de que durante la clasificación celular las células se deben ordenar directamente en trizol o un equivalente de solución de ARN compatible tal como RLT del kit RNeasy disponible a través de Qiagen.

Con el fin de identificar aberraciones que están presentes en la enfermedad, es de vital importancia que utilizamos tejidos sanos o células que se corresponden con el tipo de tejido o célula afectada por la enfermedad. Una razón para esto es que la variación epigenética entre tipos de tejidos es responsable de regular la expresión génica y es crítica para la diferenciación celular durante el desarrollo normal de 1,2 humana. Una segunda razón es que la regulación aberrante de genes específicos de tejido pueden tener consecuencias nefastas sobre el desarrollo normal y se sabe que contribuyen a una multitud de estados de enfermedad, incluyendo el cáncer. Por lo tanto, una mejor comprensión de una enfermedad que implica a las células hematopoyéticas requiere el conocimiento de las células hematopoyéticas sanas. El desarrollo de las células hematopoyéticas en la médula ósea procede a través de una orden sistemático de los eventos que se caracterizan por cambios en la expresión de marcadores de superficie celular 3. Estudios con participantes adultos tienendemostrado que la médula ósea contiene generalmente un bajo número de precursor de células B 4,5; mientras que los estudios con participantes pediátricos han demostrado que el porcentaje de precursor de células B es relativamente alta en los individuos de menos de 5 años de edad 6. Sangre de cordón umbilical se utiliza como una fuente de células madre hematopoyéticas en el tratamiento de trastornos relacionados con la sangre y tumores malignos, está fácilmente disponible a través de los bancos de sangre de cordón y está enriquecida en B y las células T inmaduras 7 que son las células diana de múltiples trastornos, incluyendo la leucemia y los linfomas. Precursor de células B en la médula ósea han sido ampliamente phenotyped 8,9 y puede ser definido por la presencia de marcadores específicos de la superficie celular que se pueden utilizar para clasificar estas células en subconjuntos distintos. Normales de células B. Con la diferenciación a través de una serie de etapas en la médula ósea a partir de los primeros pro-células B y culminando en inmaduros o ingenuo células B. Conformevan a Zelm y colegas 10, pro-células B se caracterizan por la presencia de CD34 y en la transición a la etapa 2 (Pre-BI) CD19 se adquirieron. Células de la etapa 3 (Pre-BII) ya no expresan CD34 y comienzan a expresar IgM citoplásmica. Finalmente, una característica definitoria de la etapa 4 (inmadura de células B) es la expresión de IgM de superficie. La estrategia de clasificación se describe en este protocolo fue descrito por primera vez por Caldwell y colegas 6 e incluye el uso de sólo 3 marcadores de superficie celular que reduce considerablemente la complejidad y el coste de la realización de experimentos de clasificación de células. En su trabajo, una relación entre CD45 y las etapas de diferenciación de células B se estableció. Ellos observaron que las células B en la médula ósea mostrar niveles variables de expresión de CD45. Específicamente, las células que expresaron altos niveles de CD45 correspondieron a células que expresan IgM de superficie (células B inmaduras), aquellos que expresan un nivel intermedio de CD45 correspondieron a células que expresaron cytoplasmic IgM (pre-BII células), y las que expresan bajos niveles de CD45 correspondieron a células que no expresan IgM citoplásmica (pre-BI células). Este protocolo utiliza la estrategia desarrollada por Caldwell y colegas 6 para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical (Figura 1) que pueden ser utilizados en ensayos de aguas abajo que requieren alta calidad de ácidos nucleicos tales como el ensayo isla CpG metilado-recuperación (MIRA ) 11 y cuantitativos ensayos de PCR en tiempo real. El método emplea una separación inicial usando perlas magnéticas para agotar todas las células no-B de sangre del cordón umbilical y requiere sólo la tinción con anticuerpos 3 (CD34, CD19 y CD45). Las células que se recuperan representan 4 estadios de diferenciación de células B: 1) CD34 +, CD19 + (tarde) pro-B y principios de pre-BI, 2) CD34 -, CD19 +, CD45 baja (finales de pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), y 4) CD34 -; CD19 +; CD45 alta (células B inmaduras).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

Sangre del cordón umbilical es altamente enriquecida en células progenitoras hematopoyéticas en diferentes etapas del linaje de compromiso. Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de precursor de células B en cuatro etapas diferentes de diferenciación. Debido a que los genes se expresan y modificaciones epigenéticas ocurrir en una manera específica de tejido, que es vital para discriminar entre tejidos y tipos de células con el fin de ser capaz de identificar alteraciones en el genoma y el epigenoma que puede conducir al desarrollo de la enfermedad. Este método puede ser adaptado a cualquier tipo de célula presente en la sangre del cordón umbilical en cualquier etapa de diferenciación. Este método comprende 4 etapas principales. Primero, las células mononucleares se separan por centrifugación de densidad. En segundo lugar, las células B se enriquecen usando biotina conjugado con anticuerpos que reconocen y eliminar los no células B de las células mononucleares. Terceros las células B están marcadas fluorescentemente con anticuerpos proteína de superficie celular específicos para las etapas individualesde desarrollo de células B. Finalmente, las células marcadas fluorescentemente se ordenan y poblaciones individuales se recuperan. Las células recuperadas son de cantidad y calidad suficiente para ser utilizada en posteriores ensayos de ácidos nucleicos.

Entre muestra de variación desempeña un papel en el éxito de la especie celular (Tabla 1). Las muestras con buenas tasas de éxito tienen bajos niveles de contaminación de desechos (Figura 3A) y las muestras con escaso éxito tienen altos niveles de contaminación de desechos (Figura 3B). Entre la muestra variación puede ser algo controlado si la muestra de sangre del cordón umbilical se recogió dentro de las 24 horas de embarque (O / N prioritario). Las células de flujo según de cada precursor de células B son subconjunto de cantidad y calidad suficientes para realizar aislamientos de ácido nucleico. El ADN aislado es de alta calidad y pueden ser utilizados en los análisis. En forma rutinaria utilizar este ADN en MIRA 11 para enriquecer el ADN metilado (Figura 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cable de datos de las instalaciones de sangre </td><td> Ordenar Malo </td><td><strong&gt; Ordenar Buena </td></tr><tr><td> Sangre con anticoagulante Volumen de trabajo (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> Glóbulos blancos [10 3 / l] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Los linfocitos [10 3 / l] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Linfocitos (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Glóbulos rojos [10 6 / l] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> En casa de Datos </td></tr><tr><td> Móvil Número después de Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Número de células después de la separación MACS </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Eventos Count Total (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> Viabilidad (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Las células de puerta de linfocitos (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 bajo </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 alto </td></tr><tr><td> Número total de células </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Del Total de eventos </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Eficiencia </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Representante estadísticas de clasificación celular. Filas 1-5 son cuentas que ofrece el centro de sangre del cordón umbilical. Las filas restantes son datos recogidos en nuestro laboratorio. El tipo pobre contenía altos niveles de residuos y un bajo porcentaje de células en la puerta de linfocitos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figure 1. Diagrama de flujo del procedimiento. Sangre del cordón umbilical se procesa y las células mononucleares se aíslan usando Ficoll-Paque Plus. Una etapa adicional de lavado se incluye para eliminar las plaquetas contaminantes. Las células B se aíslan de las células mononucleares utilizando la MACS de células B humanas kit de aislamiento (B-CLL). Este paso se utiliza biotina-conjugado con anticuerpos monoclonales (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE y CD235a) para eliminar todas las células no-B. Los recuperadas células B son etiquetados con CD19-APC, CD34-PE y anticuerpos CD45-FITC a continuación, ordenados usando el citómetro de flujo MoFlo XDP para recuperar precursores de células B subconjuntos: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 baja , CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Figura 2. Gating estrategia para identificar y clasificar poppoblaciones. Las flechas rojas indican la puerta que se aplica a la trama subsiguiente. Puertas R4, R5, R6 y R7 indican poblaciones ordenadas. A) Avanzar vs trama lado de dispersión que muestra la población de linfocitos enriquecido. Puerta R1, linfocitos. B) Altura vs ancho del gráfico de dispersión hacia adelante para identificar células individuales en comparación con dobletes. R2, puerta única célula. C) CD19-APC células positivas se dividen en poblaciones de CD34-PE negativos y positivos. R3, CD19 + / CD34 - puerta, R4, CD19 + / CD34 + puerta indicando población deseada tipo d) CD19 + / CD34 - las células se dividen en tres un tanto distintas CD45-FITC poblaciones.. R5 y R6, CD19 + / CD34 - / CD45 y CD19 baja + / CD34 - / CD45 poblaciones med, respectivamente. R7, por el número de células altas en el CD19 + / CD34 - / CD45 población, esta puerta especie abarca sólouna parte de la población. Todas las células de esta población no necesitan ser recogidos para los análisis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Figura 3. A) Los bajos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna. R1, puerta de linfocitos. B) Los altos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Figura 4. Enriquecimiento de ADN metilado de los subgrupos de células B precursoras. Un ADN) Sonicated aislado de precursores de células B de subconjuntos es de alta calidad. Para la construcción de ADN de biblioteca se somete a sonicación a una media de 200-600 pb. Carril 1: escalera de 100 pb Promega (catálogo # G2101); Carril 2: ADN total aislado de CD19 + / CD34 + células; Línea 3: El ADN total aislado de CD19 + </shasta&gt; / CD34 - / células CD45 bajos; Carril 4: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - / CD45 células Med; Carril 5: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - CD45 / células de alta. ADN se sometió a ultrasonidos utilizando el Bioruptor Diagenode en alta para un total de 9 min (30 seg ON; 30 seg OFF). ADN fue purificado en columna y se visualizaron en un gel de agarosa 1% con SYBR verde gel de ácido nucleico mancha. B) Después de MIRA utilizando el ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR con SLC25A37 (1-6) y CAp1 (7-12) se realiza para confirmar enriquecimiento de ADN metilado. 1 y 7: DNA genómico sonicated (no MIRA), 2 y 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 y 9: MIRA-CD19 + / CD34 - DNA / CD45 bajo, 4 y 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med ADN; 5 &amp; 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 ADN de alto, 6 y 12: El control del agua. Mayor amplificación de SLC25A37 confirma el enriquecimiento de ADN metiladoen los subconjuntos de células B precursoras.

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K vistas.  University of Missouri-Columbia. Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

El agotamiento de las poblaciones de células específicas por el agotamiento del complemento

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Aislamiento de células de ratón cavidad peritoneal

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Aislamiento de células del cerebro y la médula espinal mononucleares uso de gradientes de Percoll

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

La expansión de los linfocitos T citotóxicos sangre del cordón umbilical que Citomegalovirus Target, Virus de Epstein-Barr, adenovirus y

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

Desarrollo de un Varicela-Zoster inmunidad mediada por células específicas del virus de IFN-γ ELISPOT ensayo para evaluar la raíz del cordón umbilical de Trasplante de Sangre

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...