Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente y las líneas celulares primarias se están convirtiendo en una parte integral del desarrollo de fármacos y la iniciación y progresión de la investigación en biología tumoral. Los modelos de xenoinjertos derivados del paciente preservan la apariencia histológica de las células cancerosas, retienen la heterogeneidad intratumoral y reflejan mejor los componentes humanos relevantes del microambiente tumoral. Sus modelos son para representaciones más precisas del cáncer humano que las líneas celulares de cáncer tradicionales y tienen el potencial de mejorar la evaluación preclínica de nuevas terapias contra el cáncer.
Además, estos modelos pueden ser útiles para comparar características moleculares o firmas tumorales entre diferentes subgrupos de pacientes con cáncer. Los ratones NSG se recomiendan como modelo inmunodeficient de ratón. Debido a la inmunodeficiencia grave de los ratones, la esterilidad debe mantenerse en todos los experimentos.
En condiciones estériles, utilice fórceps y tijeras para diseccionar cuidadosamente los tejidos tumorales y recortarlos en varios trozos pequeños. Después de anestesiar el ratón, utilice tijeras estériles para hacer una incisión de un centímetro en ambos flancos dorsales. Use fórceps estériles para interrumpir el tejido subcutáneo.
Luego, corta un pedazo del tejido tumoral y colóquelo en el sitio profundo. Cierre el área del implante por sutura subcutánea con agujas de sutura quirúrgicas. Esterilice la herida con yodo.
Después de esto, coloque suavemente los ratones en una jaula vacía mientras mantiene la recumbencia esternal. Preste mucha atención a los ratones, ya que deben despertarse y comenzar a caminar después de aproximadamente tres a cuatro minutos. Coloque ratones que se sometieron a cirugía en una nueva jaula separada de las personas no sometidas a cirugía.
Evalúe el tamaño del tumor mediante la palpación del sitio de implantación y mida con una pinza Vernier dos veces por semana. Después de eutanasiar los ratones, utilice fórceps estériles y tijeras para aislar lentamente el tumor de los ratones. Lavar los tejidos tumorales en DPBS en un plato de 10 centímetros.
Se fórceps y tijeras para diseccionar y eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos sanguíneos y tejido conectivo. A continuación, usa un molde para cortar los tejidos tumorales a un grosor máximo de un milímetro. Lavar las rodajas tumorales con DPBS en un plato de 10 centímetros.
Para comenzar el proceso de vitrificación, utilice fórceps para transferir las rodajas al tubo V1 e incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos. Enrolle e invierta brevemente el tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante otros cuatro minutos. A continuación, vierta la solución V1 y las rodajas en un plato de 10 centímetros y use fórceps para transferir las rodajas al tubo V2. Incubar a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos.
Rodar e invertir el tubo brevemente e incubarlo a cuatro grados centígrados durante otros cuatro minutos. Después de esto, vierta la solución V2 y las rodajas en un plato de 10 centímetros. Transfiera las rodajas al tubo V3 e incubar a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.
Enrolle e invierta brevemente el tubo e incubar a cuatro grados centígrados durante otros cinco minutos. Asegúrese de que todas las rodajas se hundan hasta la parte inferior del tubo. Si varias rodajas permanecen flotando, enrolle e invierta el tubo brevemente e incubar a cuatro grados centígrados hasta que todas las rodajas se hundan completamente.
A continuación, vierta la solución V3 y las rodajas en un plato de 10 centímetros. Corte los soportes de tejido a la longitud adecuada y colóquelos en una gasa estéril. Transfiera las rodajas a los soportes.
Envuelva los soportes con gasa. Usando fórceps, coloque los soportes en nitrógeno líquido y déjelos incubar durante cinco minutos. Después de esto, etiquete los viales criogénicos con la información del tejido.
Transfiera los soportes con rodajas de tejido a los viales, que se almacenarán en nitrógeno líquido. En primer lugar, resect muestras de cáncer gástrico de especímenes resecados o tejidos PDX cosechados. Coloque los tejidos sobre hielo y transfieralos a un plato de cultivo estéril de 10 centímetros.
Utilice fórceps y tijeras para eliminar áreas necróticas, tejido graso, coágulos sanguíneos y tejido conectivo. Lavar los tejidos tumorales una vez con DPBS que contiene penicilina y estreptomicina en una placa de 10 centímetros. A continuación, corta el tumor en trozos de la tapa del plato.
El espesor máximo de cada pieza debe ser de un milímetro. Transfiera las piezas a un tubo centrífugo de 50 mililitros que contenga siete mililitros de una solución de colagenasa y tripina tipo 1. Vórtice la mezcla brevemente.
Incubar en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 a 40 minutos, asegurándose de vórtice la mezcla cada cinco minutos. Después de esto, añadir un volumen igual de RPMI-1640 medio complementado con 10%FBS y vórtice la mezcla a fondo. Transfiera esta mezcla a un nuevo tubo centrífugo de 50 mililitros por filtración lenta a través de un filtro de 40 microlitro.
Centrifugar los filtrados a una velocidad entre 113 y 163 veces g durante cinco a siete minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado este sobrenadante. Lavar el pellet con cinco mililitros de PBS y retirar cuidadosamente el sobrenadante.
Si el pellet es rojo, contiene eritrocitos. Resuspender suavemente el pellet con 500 microlitros de tólisis de glóbulos rojos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue cinco mililitros de PBS.
Centrifugar a una velocidad entre 113 y 163 veces g durante cinco a siete minutos a temperatura ambiente. Retire cuidadosamente el sobrenadante y resusppend el pellet con medio de cultivo y transfiera la mezcla a un plato estéril de 10 centímetros. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono, asegurándose de reemplazar el medio por un medio que contenga suero cada dos o tres días.
En este estudio, se establecen modelos de cáncer gástrico PDX y líneas celulares primarias. Se observa que los tumores de primera generación crecen más lentamente que los de generaciones posteriores, tardando tres semanas o más en alcanzar el tamaño adecuado. La tasa de éxito de la formación de tumores subcutáneos de primera generación es superior al 80% La identidad de las células cancerosas de los modelos PDX se confirma a partir de los modelos PDX mediante tinción H&E.
La tasa de éxito de la formación de tumores a partir del tejido tumoral crioconservado se observa que es aproximadamente 95%Células tumorales pueden ser fácilmente reconocidas por diferencias en la morfología. Las células primarias son autenticadas independientemente por dos patólogos bajo un microscopio. Para una confirmación adicional, la tinción de H&E se utiliza para observar la morfología celular del cáncer después de la fijación.
La tasa de aislamiento exitoso de las líneas celulares primarias es de aproximadamente 40%Estos modelos han demostrado ser predictivos de los resultados clínicos y están siendo utilizados para la evaluación preclínica de fármacos mediante una identificación de marcadores, estudios biológicos y estrategias de medicina personalizada.
