Se necesitan modelos para imitar constantemente la metástasis del cáncer a través de la interacción con los ganglios linfáticos. En pacientes con cáncer colorrectal y cáncer de células uroteliales de la vejiga. Nuestros modelos xenográficos ortotópicos descritos en este artículo pueden ayudar a responder a estas importantes preguntas biológicas y probar nuevas terapias de manera eficiente y clínicamente relevante.
Nuestros tumores de xenoinjerto ortotópico producidos en ratones se asemejan al tumor de los pacientes. En presencia de células estromales de ganglios linfáticos, ambos modelos tienen una implantación tumoral más alta y tasas de metástasis de órganos distantes y ubicaciones que imitan los patrones metastásicos humanos. Además, ambos modelos animales tienen cero mortalidad relacionada con procedimientos.
Después de extraer tumores derivados del paciente de ratones eutanizados, utilice tijeras quirúrgicas esterilizadas para picar piezas de tumores positivos luciferasa lo más pequeñas posible en un plato de petri bajo una capucha de flujo laminar. Transfiera las piezas tumorales a un tubo cónico estéril de 50 ml. Para preparar la solución digesta, añadir 10 ml de colagenasa tipo 4, 80 microlitros de hialuronidasa y 160 microlitros de desoxirribonucleasa tipo 1 a 40 ml de HBSS y mezclar por invertir.
Añadir 35-40 mL de la solución digesta al tumor picado e incubar a 37 grados Celsius con rotación continua durante 2 horas con agitación vigorosa periódica. Para eliminar los desechos después de la digestión, filtre el tumor digerido a través del colador estéril de 100 micrómetros seguido de filtración a través de un colador celular de 40 micrómetros que salva el flujo a través de un tubo de 50 ml cada vez y descarta los desechos. Para lavar las células libres, agregue 20 ml de HBSS al flujo a través y centrifugar a 329 veces la gravedad durante 5 minutos.
Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 30 ml de HBSS. Transfiera 100.000 células tumorales a un tubo cónico estéril de 15 ml y agregue 300.000 células seguras de HK frescas previamente preparadas. Centrifugar las células a 329 veces la gravedad durante 5 minutos y desechar el sobrenadante por aspiración.
Resuspender las células en medio de RPMI completo y mantener en hielo hasta que estén listas para su uso. Para preparar al animal para la inyección de células UCC use crema de depilación para afeitar la parte inferior de la espalda de un ratón NOD-SCID hembra de 6-8 semanas de edad. Para administrar células UCC en una vejiga, primero configure una máquina de electrocauterización monopolar a una potencia de 4 vatios.
Después de anestesiar el ratón, colóquelo en posición supina con su hocico en un cono de nariz de isoflurano y la espalda desnuda firmemente puesta a tierra sobre un electrodo disperso. Lubricar un angiocatéter de calibre 24 con gelatina lubricante y luego insertar el angiocatéter suavemente pero firmemente a través de la uretra del ratón. Si el catéter se dobla al entrar, inserte el alambre guía hasta la mitad del catéter para proporcionar estabilidad.
A continuación, inserte completamente el cable guía recto de núcleo fijo de 0,64 milímetros 1 milímetro más allá del final del angiocatéter. Sostenga el pasador monopolar al cable guía durante un segundo permitiendo una irritación eléctrica de la mucosa de la vejiga. Adjunte un angiocatéter fresco y estéril a la jeringa de bloqueo de leur de 1 ml y extraiga hasta 200 microlitros de células UCC preparadas en pasos anteriores.
Retire el alambre guía y el angiocatéter de la uretra y luego inserte el angiocatéter con una jeringa de células unidas a él. Inyectar 50 microlitros de las células en la vejiga del ratón y permitir que las células se adhieran a la pared de la vejiga, espere unos segundos antes de extraer el angiocatéter. Por último, retire el ratón del cono nasal isoflurano y de la almohadilla de puesta a tierra y observelo durante 1 hora después del procedimiento para detectar signos de angustia.
Para crear el modelo de ratón CRC, coloque un ratón noD-SCID macho anestesado de 6-8 semanas de edad en posición supina bajo un microscopio diseccionador que asegura el hocico y el cono de nariz isoflurano y las extremidades delanteras con cinta adhesiva para la estabilidad. Coloque un objeto pequeño, como una pequeña sección de gasa debajo de la base de la cola, elevando el ano para mejorar la visibilidad y el ángulo. Utilice fórceps con puntas contundentes lubricadas curvadas para dilatar el canal anal y exponer la mucosa anal y rectal distal y eliminar las heces.
Conecte una aguja extraíble estéril de calibre 30 a una jeringa de vidrio de 50 microlitrotros. Dibuje 10 microlitros de suspensión celular de tumores y células HK preparadas en pasos anteriores en la jeringa. Inyecte los 10 microlitros en la submucosa rectal posterior distal de 1-2 milímetros por encima del canal anal asegurándose de no pasar a la cavidad pélvica.
Por último, retire el ratón del cono nasal isoflurano y observelo durante una hora después del procedimiento para detectar signos de angustia. Para controlar semanalmente el tumor primario, la carga metastásica hepática y pulmonar en cualquiera de los modelos de ratón, primero, pese el ratón. Inyectar 150 mg/kg de luciferina intra peritonealmente y esperar 5 minutos para que el sustrato circule en el cuerpo.
Coloque el ratón anestesiado en un sistema de imágenes bioluminiscentes con la nariz fijada en el cono nasal asegurándose de que el área de interés, que es el lado ventral del animal está frente a la cámara para cada imagen. Imagen del ratón en posición supina semanalmente para la actividad de la luciferasa. Después de cortar y manchar los tejidos aislados incrustados en parafina, observarlos usando un microscopio de alta potencia.
En el modelo de ratón UCC, el 83,3 por ciento de los animales generó tumores primarios y mostró un crecimiento de tumor primario dependiente del tiempo basado en mediciones semanales de bioluminiscencia. En el modelo de ratón CRC, el 96,9% de los ratones cultivaban tumores primarios. Dependiendo del tumor del paciente, el crecimiento del tumor de ratón tuvo un período de latencia diferente, que refleja la diferencia en las características clínicas de los pacientes.
En los modelos intra-vesícula e intra-rectal, la inyección de células tumorales generó tumores primarios ortotópicos. Además, el 33,3% y el 53,1% de los ratones inculcados con células UCC y células CRC con células HK, respectivamente, desarrollaron metástasis de órganos distantes. La histopatología de los xenoinjertos en el modelo UCC se comparó con el carcinoma de vejiga del paciente primario.
Los resultados de tinción de los xenoinjertos fueron similares a los de las biopsias quirúrgicas originales, lo que confirma una morfología tisular similar. Los anticuerpos a Ki67, un marcador de proliferación de células humanas, muestran una tinción nuclear positiva que indica células tumorales humanas altamente proliferantes y de rápido crecimiento. Del mismo modo, en el modelo CRC, la tinción de H&E indica la similitud de la arquitectura entre los xenoinjertos y los tumores de pacientes.
La tinción de anticuerpos contra la citoqueracina 20 también mostró un patrón de crecimiento tumoral similar en ambos modelos CRC. La clave de estos procedimientos es tratar a los animales con su cuidado, pero con firmeza. Practicar con una mano firme es la mejor manera de realizar estas técnicas de forma segura y lograr los mejores resultados.
Una vez que se fabrican estos modelos, se pueden probar múltiples formas diferentes de terapias oncológicas, incluyendo combinaciones de fármacos actuales, así como terapias recientemente desarrolladas antes de los ensayos clínicos en pacientes. Es importante recordar que el manejo de las células cancerosas y las agujas debe ser realizado por personal experimentado para su seguridad, así como para lograr resultados óptimos.
