I modelli xenograft derivati dal paziente e le linee cellulari primarie stanno diventando parte integrante dello sviluppo del farmaco e dell'iniziazione e della progressione della ricerca sulla biologia tumorale. I modelli xenograft derivati dal paziente preservano l'aspetto istologico delle cellule tumorali, mantengono l'eterogeneità intratumorale e riflettono meglio i componenti umani rilevanti del microambiente tumorale. I suoi modelli sono per rappresentazioni più accurate del cancro umano rispetto alle tradizionali linee cellulari tumorali e hanno il potenziale per migliorare la valutazione preclinica di nuove terapie anticancro.
Inoltre, questi modelli possono essere utili per confrontare le caratteristiche molecolari o le firme tumorali tra diversi sottogruppi di pazienti oncologici. I topi NSG sono raccomandati come modello di topo immunodifeso. A causa della grave immunodeficienza dei topi, la sterilità deve essere mantenuta in tutti gli esperimenti.
In condizioni sterili, utilizzare forcelle e forbici per sezionare attentamente i tessuti tumorali e tagliarli in diversi piccoli pezzi. Dopo aver anestetizzato il topo, usa forbici sterili per fare un'incisione di un centimetro su entrambi i fianchi dorsali. Utilizzare forcelle sterili per interrompere il tessuto sottocutaneo.
Quindi, aggancia un pezzo del tessuto tumorale e mettilo nel sito profondo. Chiudere l'area dell'impianto per sutura sottocutanea con aghi di sutura chirurgica. Sterilizzare la ferita con iodio.
Dopo questo, posizionare delicatamente i topi in una gabbia vuota mantenendo la reclinanza sternale. Presta molta attenzione ai topi perché dovrebbero svegliarsi e iniziare a camminare dopo circa tre o quattro minuti. Posizionare i topi sottoposti a intervento chirurgico in una nuova gabbia separata da quelli non sottoposti a intervento chirurgico.
Valutare la dimensione del tumore palpando il sito di impianto e misurarli con una pinza Vernier due volte a settimana. Dopo aver eutanasiato i topi, utilizzare forcep e forbici sterili per isolare lentamente il tumore dai topi. Lavare i tessuti tumorali in DPBS in un piatto di 10 centimetri.
Si forzano e forbici per sezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo. Successivamente, utilizzare uno stampo per tagliare i tessuti tumorali a uno spessore massimo di un millimetro. Lavare le fette tumorali con DPBS in un piatto di 10 centimetri.
Per iniziare il processo di vetrificazione, utilizzare le forcep per trasferire le fette nel tubo V1 e incubare a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius per altri quattro minuti. Quindi, versare la soluzione V1 e le fette in un piatto di 10 centimetri e utilizzare le forcep per trasferire le fette nel tubo V2. Incubare a quattro gradi Celsius per quattro minuti.
Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubarlo a quattro gradi Celsius per altri quattro minuti. Dopo questo, versare la soluzione V2 e le fette in un piatto di 10 centimetri. Trasferire le fette nel tubo V3 e incubare a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Arrotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius per altri cinque minuti. Assicurarsi che tutte le fette affondino sul fondo del tubo. Se diverse fette rimangono galleggianti, rotolare e invertire brevemente il tubo e incubare a quattro gradi Celsius fino a quando tutte le fette affondano completamente.
Quindi, versare la soluzione V3 e le fette in un piatto di 10 centimetri. Tagliare i supporti del tessuto alla lunghezza corretta e posizionarli su una garza sterile. Trasferire le fette sui supporti.
Avvolgere i supporti con garza. Utilizzando le bombole, posizionare i supporti in azoto liquido e lasciarli incubare per cinque minuti. Successivamente, etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sui tessuti.
Trasferire i supporti con fette di tessuto nelle fiale, che verranno conservate in azoto liquido. In primo luogo, i campioni di cancro gastrico resect da campioni reinsediati o tessuti PDX raccolti. Posizionare i tessuti sul ghiaccio e trasferirli in un piatto di coltura sterile di 10 centimetri.
Usa flessidi e forbici per rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo. Lavare i tessuti tumorali una volta con DPBS contenente penicillina e streptomicina in un piatto di 10 centimetri. Quindi, tagliare il tumore a pezzi sul coperchio del piatto.
Lo spessore massimo di ogni pezzo dovrebbe essere di un millimetro. Trasferire i pezzi in un tubo di centrifuga da 50 millilitri contenente sette millilitri di una soluzione di collagenasi e tripparina di tipo 1. Vortice brevemente la miscela.
Incubare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30-40 minuti, assicurandosi di vortice la miscela ogni cinque minuti. Successivamente, aggiungere un volume uguale di mezzo RPMI-1640 integrato con 10%FBS e vortice accuratamente la miscela. Trasferire questa miscela in un nuovo tubo di centrifuga da 50 millilitri mediante filtrazione lenta attraverso un filtro da 40 microlitri.
Centrifugare i filtrati ad una velocità compresa tra 113 e 163 volte g per cinque-sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura questo supernatante. Lavare il pellet con cinque millilitri di PBS e rimuovere con cura il supernatante.
Se il pellet è rosso, contiene eriociti. Rimescolare delicatamente il pellet con 500 microlitri di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere cinque millilitri di PBS.
Centrifuga a una velocità compresa tra 113 e 163 volte g per cinque-sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cura il supernatante e risospendire il pellet con il mezzo di coltura e trasferire la miscela in un piatto sterile di 10 centimetri. Incubare la coltura a 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%, assicurandosi di sostituire il mezzo con mezzo contenente siero ogni due o tre giorni.
In questo studio vengono stabiliti modelli PDX di cancro gastrico e linee cellulari primarie. Si vede che i tumori di prima generazione crescono più lentamente di quelli delle generazioni successive, richiedendo tre settimane o più per raggiungere le dimensioni appropriate. Il tasso di successo della formazione di tumori sottocutanei di prima generazione è superiore all'80%L'identità delle cellule tumorali dai modelli PDX è confermata dai modelli PDX dalla colorazione H&E.
Il tasso di successo della formazione tumorale dal tessuto tumorale crioconservato è visto come circa il 95%Le cellule tumorali possono essere facilmente riconosciute dalle differenze morfologiche. Le cellule primarie sono autenticate indipendentemente da due patologi al microscopio. Per ulteriori conferme, la colorazione H&E viene utilizzata per osservare la morfologia delle cellule tumorali dopo la fissazione.
Il tasso di isolamento riuscito delle linee cellulari primarie è di circa il 40%Questi modelli hanno dimostrato di essere predittivi dei risultati clinici e vengono utilizzati per la valutazione preclinica dei farmaci mediante identificazione marcatore, studi biologici e strategie di medicina personalizzata.
