Este protocolo proporciona una manera de evaluar la participación de un determinado factor en la doble fertilización de Arabidopsis. El estado de fertilización se puede juzgar por la morfología de los núcleos esperma de un vistazo, por lo que la rápida obtención de los datos para el análisis estadístico es posible. Este método es específico para la evaluación del fenotipo de fertilización en Arabidopsis.
Todavía hay reguladores de fertilización desconocidos, incluso si en Arabidopsis. Este método sería útil para el análisis funcional de futuros factores de fertilización desconocidos. Dominar la habilidad de manejo rápido e intacto de los ovules son importantes para el éxito de este análisis.
Para empezar, crece Arabidopsis thaliana a 22 grados celsius bajo un ciclo de 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad en una cámara de crecimiento. Cortar y eliminar el primer tallo de flores desarrollado con tijeras para promover el desarrollo de cogollos axilares. Dos a tres semanas después de cortar el primer tallo, medir la altura de la planta.
Las plantas con una altura superior a 25 centímetros se consideran plantas de crecimiento vigoroso y son adecuadas para el análisis. Para emascular, busca cogollos en la etapa 11 con trozos de pétalos vistos en la parte superior. Usa un número cinco fórceps para eliminar el sépalo, el pétalo y el estambre de los brotes florales.
15 a 18 horas después de la emasculación, tome el estambre de una línea de derribo DMP9 con fondo de la flor HTR10-mRFP en la etapa 13 pellizcando el filamento con fórceps. Para polinizar, acaricia suavemente el estigma de un pistilo emasculado varias veces con una anteratera dehiscente. Siete a ocho horas después de la polinización, recoger el pistilo y colocarlo en la cinta de doble cara.
A continuación, presione suavemente con fórceps para fijar el pistilo en la cinta. Bajo un microscopio de disección, corte los extremos superior e inferior del ovario con una aguja de inyección. Mueva la punta de la aguja de inyección para cortar la pared del ovario a ambos lados del replio.
Cortar cuidadosamente para no separar el funiculus y el tracto transmisor. Evert la pared del ovario. Pinche la base del tabique al que están conectados los óvulos y levántelo cuidadosamente con fórceps.
Transfiera los óvulos en una gota de agua en un vaso deslizante y cúbralos suavemente con una cubierta para la observación bajo un microscopio de fluorescencia. En un microscopio de epifluorescencia equipado con un cubo de filtro de fluorescencia, ajuste la lente objetivo a 20x o 40x. Adquirir imágenes de los óvulos que contienen núcleos esperma etiquetados con mRFP.
Confirme el número de núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP en un saco embrionario. Confirme la forma y la posición de cada núcleo espermático con etiqueta mRFP en un saco embrionario. En este estudio, los fenotipos de fertilización fueron juzgados por morfología de la señal nuclear de espermatozoides en el óvulo.
La mayoría de los óvulos contenían dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP descondensados en el lado micropilar de células de óvulo y el lado final del charazal de la célula central. Esto indica una doble fertilización exitosa. Además, se observaron óvulos que contenían un núcleo espermático descondensado con mRFP en el núcleo celular central más un núcleo de espermatozoides con mRFP condensado fuera de la célula del óvulo, lo que indica una sola fertilización.
En el caso de la doble fertilización fallida, se observaron dos núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP condensada en el límite de la célula de óvulo y la célula central. En el análisis utilizando la línea DMP9-knockdown con fondo de polen HTR10-mRFP, rara vez se observaron óvulos que contenían un solo núcleo de espermatozoides con etiqueta mRFP condensada o tres o más núcleos de espermatozoides con etiqueta mRFP. Combinando con el uso de líneas de marcador femeninas, se puede analizar un estado de fertilización más preciso.
Por ejemplo, el estado de fertilización después de la fusión gameto y antes de la cariogamia puede ser juzgado. Sí, el proceso de fertilización se divide en varios pasos. Las preguntas que cada regulador de fertilización implica en qué pasos se pueden responder con este método mejorado.
Proporcionaría una visión más profunda de la reproducción sexual de la planta.
