פרוטוקול זה מספק דרך להעריך את מעורבותו של גורם מסוים להפריה כפולה של ערבידופסיס. מצב ההפריה יכול להישפט על ידי המורפולוגיה של גרעיני הזרע במבט חטוף, ולכן קבלתם המהירה של הנתונים לניתוח סטטיסטי אפשרית. שיטה זו ספציפית להערכה של פנוטיפ הפריה ב Arabidopsis.
יש עדיין רגולטורים לא ידועים להפריה, גם אם ערבידופסיס. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח תפקודי של גורמי הפריה לא ידועים בעתיד. כדי לשלוט במיומנות של טיפול מהיר שלם של הביציות חשובים להצלחת ניתוח זה.
כדי להתחיל, לגדל ערבידופסיס thaliana ב 22 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור 16 שעות ושמונה שעות חשוך בתא צמיחה. חותכים ומסירים את גבעול הפרחים המפותח הראשון עם מספריים כדי לקדם את הפיתוח של ניצנים ביתר. שבועיים עד שלושה שבועות לאחר ניתוק הגבעול הראשון, למדוד את גובה הצמח.
צמחים בגובה מעל 25 ס"מ נחשבים לצמחים הגדלים במרץ ומתאימים לניתוח. כדי לסרס, לחפש ניצנים בשלב 11 עם פיסות עלי כותרת לראות בחלק העליון. השתמש במספר חמש מדפים כדי להסיר עלי גביע, עלי כותרת, אבקן של ניצני פרחים.
15 עד 18 שעות לאחר סיכול, לקחת את היכל של קו נוקאאוט DMP9 עם רקע של פרח HTR10-mRFP בשלב 13 על ידי צביטת התסיסה עם ממטרות. כדי להאביק, לטפוח בעדינות את הסטיגמה של pistil מקורס מספר פעמים עם anther dehiscent. שבע עד שמונה שעות לאחר ההאבקה, לאסוף את pistil ולמקם אותו על הקלטת דו צדדית.
לאחר מכן, לחץ בעדינות עם מדפים כדי לתקן את pistil בקלטת. תחת מיקרוסקופ לנתח, לחתוך את הקצוות העליונים והתחתונים של השחלה באמצעות מחט הזרקה. להזיז את קצה מחט ההזרקה כדי ל חסוף את קיר השחלה לאורך שני הצדדים של replum.
חותכים בזהירות כדי לא להפריד את funiculus ואת דרכי המשדר. אוורט קיר השחלה. צובטים את בסיס המחיצה שאליו מחוברות הביציות, ומרימים אותו בזהירות במלקחיים.
מעבירים את הביציות לטיפה של מים על מגלשה, ומכסים בעדינות בכיסוי לתצפית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במיקרוסקופ epifluorescence המצויד בקוביית מסנן פלואורסצנטיות, התאימו את העדשה האובייקטיבית ל-20x או 40x. לרכוש תמונות של הביציות המכילות גרעיני זרע שכותרתו עם mRFP.
אשר את מספר גרעיני הזרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. אשר את הצורה והמיקום של כל גרעין זרע המסווים ב- mRFP בוואק עובר. במחקר זה, פנוטיפים הפריה נשפטו על ידי מורפולוגיה אות גרעיני זרע ביצית.
רוב הביציות הכילו שני גרעיני זרע עם תווית mRFP בצד המיקרו-pylar של תאי הביצה ובצוד הקצה השרנזלי של התא המרכזי. הדבר מצביע על הפריה כפולה מוצלחת. בנוסף, נצפו ביציות המכילות גרעין זרע עם תווית mRFP מנומק בגרעין התא המרכזי בתוספת גרעין זרע מרוכז עם תווית mRFP מחוץ לתא הביצית, מה שמצביע על הפריה יחידה.
במקרה של הפריה כפולה כושלת, שני גרעיני זרע מרוכזים עם תווית mRFP נצפו בגבול תא הביצית והתא המרכזי. בניתוח באמצעות קו נוקאאוט DMP9-knockdown עם רקע של אבקה HTR10-mRFP, ביציות המכילות גרעין זרע אחד מרוכז mRFP שכותרתו או שלושה או יותר mRFP שכותרתו גרעיני זרע נצפו לעתים רחוקות. בשילוב עם השימוש בקווי סמן נקביים, ניתן לנתח מצב הפריה מדויק יותר.
לדוגמה, מצב ההפריה לאחר היתוך gamete ולפני karyogamy ניתן לשפוט. כן, תהליך ההפריה מחולק למספר שלבים. השאלות שכל רגולטור הפריה מעורב בהם ניתן לענות על צעדים בשיטה משופרת זו.
זה יספק תובנה עמוקה יותר על הרבייה המינית של הצמח.
