Questo protocollo fornisce un modo per valutare il coinvolgimento di un certo fattore nella doppia fecondazione dell'arabidopsis. Lo stato di fecondazione può essere giudicato dalla morfologia dei nuclei spermatica a colpo d'occhio, quindi è possibile ottenere rapidamente i dati per l'analisi statistica. Questo metodo è specifico per la valutazione del fenotipo di fecondazione in Arabidopsis.
Ci sono ancora regolatori di fecondazione sconosciuti, anche se in Arabidopsis. Questo metodo sarebbe utile per l'analisi funzionale di futuri fattori di fecondazione sconosciuti. Per padroneggiare l'abilità di una gestione rapida e intatta degli ovuli sono importanti per il successo di questa analisi.
Per iniziare, far crescere arabidopsis thaliana a 22 gradi Celsius sotto una luce di 16 ore e un ciclo buio di otto ore in una camera di crescita. Tagliare e rimuovere il primo gambo di fiori sviluppato con forbici per promuovere lo sviluppo di gemme ascellari. Due o tre settimane dopo aver tagliato il primo gambo, misurare l'altezza della pianta.
Le piante con altezza superiore a 25 centimetri sono considerate piante in crescita vigorosa e sono adatte per l'analisi. Per eviculare, cerca le gemme nella fase 11 con pezzi di petali visti in alto. Usa un numero cinque forcep per rimuovere sepali, petali e stami di boccioli di fiori.
Da 15 a 18 ore dopo l'emaculazione, prendere lo stame di una linea di abbattimento DMP9 con sfondo di fiore HTR10-mRFP allo stadio 13 pizzicando il filamento con le forcep. Per impollinare, accarezzare delicatamente lo stigma di un pistillo evirato più volte con un'ante dehiscente. Da sette a otto ore dopo l'impollinazione, raccogliere il pistillo e posizionarlo sul nastro a doppia aspetto.
Quindi, premere delicatamente con pinza per fissare il pistillo sul nastro. Al microscopio sezionato, tagliare le estremità superiore e inferiore dell'ovaio usando un ago da iniezione. Spostare la punta dell'ago di iniezione per tagliare la parete dell'ovaio lungo entrambi i lati del replum.
Tagliare con cura in modo da non separare il funicolo e il tratto trasmiminte. Evita la parete dell'ovaio. Pizzicare la base del setto a cui sono collegati gli ovuli e sollevarla con attenzione con le forcep.
Trasferire gli ovuli in una goccia d'acqua su un vetro scorrevole e coprire delicatamente con un coverglass per l'osservazione al microscopio a fluorescenza. Su un microscopio a epifluorescenza dotato di un cubo filtrante a fluorescenza, regolare l'obiettivo a 20x o 40x. Acquisire immagini degli ovuli contenenti nuclei spermatozoi etichettati con mRFP.
Confermare il numero di nuclei spermatico etichettati mRFP in un sacco embrionale. Confermare la forma e la posizione di ogni nucleo spermatico etichettato mRFP in un sacco embrionale. In questo studio, i fenotipi di fecondazione sono stati giudicati dalla morfologia del segnale nucleare dello sperma negli ovuli.
La maggior parte degli ovuli conteneva due nuclei spermatozoi decondensati etichettati mRFP sul lato micropilare degli ovociti e sul lato finale charazal della cellula centrale. Ciò indica una doppia fecondazione riuscita. Inoltre, sono stati osservati ovuli contenenti un nucleo spermatico decondensato etichettato mRFP nel nucleo cellulare centrale più un nucleo spermatico condensato etichettato mRFP al di fuori dell'ovulo, che indica una singola fecondazione.
In caso di doppia fecondazione fallita, due nuclei spermatozoi condensati etichettati mRFP sono stati osservati al confine dell'ovulo e della cellula centrale. Nell'analisi utilizzando la linea di abbattimento DMP9 con sfondo di polline HTR10-mRFP, raramente sono stati osservati ovuli contenenti un singolo nucleo spermatico condensato etichettato mRFP o tre o più nuclei spermatico etichettati mRFP. Combinandosi con l'uso di linee marcatori femminili, è possibile analizzare lo stato di fecondazione più accurato.
Ad esempio, lo stato di fecondazione dopo la fusione del gamete e prima della cariogamia può essere giudicato. Sì, il processo di fecondazione è diviso in diversi passaggi. Le domande che ogni regolatore di fecondazione ha coinvolto in quali passaggi può essere risposto con questo metodo migliorato.
Fornirebbe una visione più approfondita della riproduzione sessuale della pianta.
