Hemos desarrollado un método fácil para probar muestras de alimentos para los diferentes toxinotipos de C perfringens. Estamos particularmente interesados en la prevalencia de los toxinotipos B y D que producen la toxina de épsilon. Nuestro protocolo permite un fácil enriquecimiento y detección de los diversos toxinotipos C perfringens sin el uso de cámaras anaeróbicas o incubadoras con sub-cultivo limitado.
Este método también podría utilizarse para probar el suelo, el agua, las muestras fecales y más. Demostrando el procedimiento serán Zuha Anwar y Samantha Regan, técnicos del laboratorio. Comience preparando el medio de perfringens rápidos modificados, o RPM.
Combine los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y autoclave la mezcla a 121 grados Celsius durante 15 minutos. Deje que el medio se enfríe a aproximadamente 40 grados Celsius, luego agregue D-cicloserina a una concentración final de 440 miligramos por litro. Transfiera asépticamente las RPM a tubos cónicos de 15 mililitros, y guárdelos a cuatro grados centígrados durante un mes.
Antes de usar, calentar el medio a 37 grados Celsius. Al recoger las muestras que se van a analizar, transfiera los alimentos al laboratorio de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Si no se prueba inmediatamente, los alimentos se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados.
Tome nota del tipo de alimento y del país de origen, así como de cualquier otra información pertinente. Para probar el alimento, transfiera aproximadamente de uno a dos gramos a un plato estéril de Petri, y picar finamente con una cuchilla de afeitar estéril o bisturí. Inocularlo en 10 mililitros de PBS en un tubo cónico de 15 mililitros, y mezclar bien.
Seleccione para las células vegetativas transfiriendo cinco mililitros de la mezcla de alimentos PBS a un tubo cónico de 15 mililitros con 10 mililitros de RPM y cerrando la tapa firmemente. Seleccione las esporas calentando los cinco mililitros restantes de la mezcla a 85 grados centígrados durante 15 minutos. Y luego transferirlo a un tubo con RPM y cerrar la tapa firmemente.
Para asegurar una mezcla completa, vórtice e invertir los cultivos de RPM de los alimentos. A continuación, selle firmemente los tubos cónicos y envuelva las tapas con película de parafina para crear un ambiente anaeróbico. Incubar los tubos durante la noche a 37 grados centígrados y observar cualquier turbidez o fermentación a la mañana siguiente.
Preparar cicloserina de sulfito triptosa o agar TSC de acuerdo con la dirección del fabricante, y luego utilizar la técnica de sándwich para inocularlo con cultivos de RPM durante la noche. Preparar la capa base de las placas transfiriendo 10 mililitros del agar fundido a platos estériles de Petrie y permitiéndole solidificarse. Mantenga el agar TSC restante a 40 grados Celsius para la capa superior, y transfiera cuidadosamente 100 microlitros del cultivo de RPM durante la noche a la base del agar.
Algunos cultivos pueden estar bajo presión debido a la fermentación, así que asegúrese de usar todo el equipo de protección personal adecuado. Esparce la inoculina con perlas de vidrio estériles o un esparcidor celular, y permite que las RPM sean absorbidas en el agar durante cinco a 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta serológica para transferir cuidadosamente 20 mililitros del agar TSC fundido a la placa.
Reemplace la tapa del plato Petrie y deje que el agar TSC se solidifique completamente a temperatura ambiente, luego invierta el plato e incubarlo a 37 grados centígrados durante la noche. Si es necesario, realice diluciones en serie del cultivo de RPM antes de la inoculación en el agar TSC. Después de la incubación, examine las placas en busca de crecimiento bacteriano.
Las bacterias aeróbicas pueden estar presentes en la superficie del agar, mientras que las bacterias anaeróbicas se incrustarán en el agar. Las bacterias reductoras de sulfito volverán el agar circundante de color negro, y las posibles colonias de C perfringens serán negras e incrustadas en el agar. Si hay una cantidad densa de crecimiento bacteriano aeróbico en la superficie de la placa, utilice un rascador celular para eliminar colonias de áreas seleccionadas.
Utilice un gotero estéril de un solo uso para arrancar las sospechas de C perfringens colonias del agar, asegurándose de expulsar el aire antes de perforar el agar. Transfiera las colonias a 10 mililitros de RPM frescas en un tubo cónico de 15 mililitros. Múltiples colonias podrían ser muestreadas de la misma placa en cultivos de RPM separados.
Asegure firmemente las tapas cónicas del tubo, envuélvalas en película de parafina e incubarlas durante la noche a 37 grados centígrados. C perfringens es un organismo BSL de dos. Es importante utilizar las precauciones de seguridad adecuadas en todo momento, especialmente al abrir cultivos de RPM durante la noche y descontaminar y desechar cuidadosamente los medios usados.
Al día siguiente, retirar los cultivos nocturnos y examinarlos en busca de turbidez y fermentación, luego proceder con la extracción de ADN. Invierta suavemente el cultivo de RPM para dispersar cualquier bacteria asentada y abra cuidadosamente el tubo. Transfiera un mililitro a un tubo de microcentrífuga y pelete las bacterias por centrifugación.
Lavar el pellet con un mililitro de PBS estéril. Si la gelatina no digerido se ha asentado encima de las bacterias, esponjándola agitando con PBS. Aspirar suavemente la gelatina y el PBS y volver a suspender el pellet bacteriano restante con un mililitro de PBS fresco.
Es importante eliminar cualquier gelatina peletizada con perturbación limitada del pellet celular. La falta de eliminación de gelatina puede inhibir la extracción de ADN y la PCR. Centrifugar las bacterias durante 10 minutos y aspirar cuidadosamente el sobrenadante.
A continuación, realice la extracción de ADN utilizando un kit diseñado específicamente para bacterias gram positivas. Utilice el ADN inmediatamente o guárdelo en menos 20 grados Centígrados. Realizar PCR en el ADN extraído para determinar si los cultivos son positivos para los toxinotipos de C perfringens.
Utilice C perfringens DNA como control positivo para asegurarse de que todos los reactivos de PCR están funcionando. Ejecute el PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y analice los productos con electroforesis de gel de agarosa. Este protocolo se utilizó para probar un total de 216 muestras de alimentos compradas en tiendas minoristas de Nueva York.
Las muestras incluyeron varias muestras de carne, muestras de aves de corral y muestras de mariscos. C perfringens Tipo B se utilizó como un control positivo. Se encontró que entre el 15 y el 20% de los alimentos muestreados dan positivo para C perfringens.
De las 34 muestras positivas, 31 muestras contenían la toxina alfa, una muestra contenía la toxina alfa, beta y épsilon. Y dos muestras contenían la toxina alfa y épsilon. Hemos desarrollado un método fácil para probar muestras de alimentos para los diferentes toxinotipos de C perfringens.
Estamos particularmente interesados en la prevalencia de los toxinotipos B y D que producen la toxina de épsilon.
