Este trabajo fue financiado por el NIH subvención R01 AI073783 a K. Teter. Agradecemos al Dr. Shane Massey para la asistencia en el desarrollo del fraccionamiento subcelular de protocolo y Helen Burress para la lectura crítica del manuscrito.

1. Preparación de digitonina <ol><li> Añadir 500 l de etanol al 100% a un tubo de microcentrífuga y lo coloca en un bloque de calor fijado en 80 ° C durante 10 min. </li><li> Disolver 2,5 mg de digitonina en 250 l de etanol se calienta para producir una solución de reserva del 1% de digitonina. </li><li> Para generar una solución de trabajo de 0,04% digitonina, agregar 40 ml de la solución madre digitonina a 960 L de HCN buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM de N-ethylmaleimide, y un inhibidor de la proteasa cóctel). </li></ol> 2. Intoxicación celular y permeabilización Nuestro ensayo de translocación se puede aplicar a una serie de toxinas y líneas celulares. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para la detección de la toxina del cólera (CT). Una visión general del procedimiento está previsto en la Figura 1. <ol><li> Las células HeLa se siembran en placas de 6 pocillos con 1 ml de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos antimicóticos-para lograr 1x10 6 células / pocillo después de una noche de incubación a 37 ° C. Para generar la toxina suficiente citosólica para la detección reproducible, tres pozos son necesarios para cada condición. </li><li> Después de una incubación durante la noche, sustituir el medio de cultivo con 1 ml de DMEM que contenía 100 ng / mL de gangliósido GM1. Esto aumenta el número de sitios de unión para la TC, como el receptor GM1 de la TC se intercalan en la membrana plasmática de las células expuestas a una solución de GM1. </li><li> Después de una incubación de 1 hora a 37 ° C, se elimina el medio GM1 que contienen y se lavan las células dos veces con DMEM. Luego, coloque las células a 4 º C durante 30 minutos en 1 ml de DMEM que contenía 1 mg / ml de CT. </li><li> Eliminar el medio que contiene la toxina, se lavan las células dos veces con DMEM y se incuban las células en 1 ml de DMEM a 37 ° C para el intervalo de tiempo deseado (s). </li><li> Al final de cada período de persecución, se lavan las células con PBS e incubar cada pocillo con 250 l de 0,5 mM EDTA en PBS. Deje que las células reposar por 10<html> min a temperatura ambiente y luego sacarlos de la placa de 6 pocillos por trituración vigorosa con un p1000 Pipetman. Después de un pocillo de células que se ha recogido, que se combinan con la segunda y tercera, luego, de la misma condición. Raspadores de células también puede ser utilizado para recoger las células. </li><li> Lugar la suspensión de células combinadas de los tres pozos de replicar (750 l volumen total) en un tubo de microcentrífuga sola, y lo hace girar en una microcentrífuga de mesa durante 5 minutos a 5.000 x g. Gránulos de las células de un tamaño más o menos equivalente se debe obtener para todas las condiciones. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 100 L de la solución 0,04% de trabajo de digitonina. Lugar la suspensión de células en hielo durante 10 min. </li><li> Giro de las células digitonina permeabilized a 16.000 xg durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante citosol que contiene a un tubo de microcentrífuga nuevo, y retener la fracción orgánulos que contienen pellets. </li></ol>título &quot;&gt; 3. Preparación de la muestra <ol><li> Citosol que contiene fracciones sobrenadante se diluyen en un tampón de HCN a un volumen final de 1 mL. Volúmenes de muestra de al menos 1 ml son necesarias para asegurar el aire se purga del circuito de muestra de 500 l antes de la inyección. </li><li> Orgánulos que contienen fracciones de pellet se resuspendió en 1 ml de tampón de HCN contiene un 1% Triton X-100. Además de detergente es necesario liberar la piscina revestida de membrana de la toxina. </li><li> Normas de la toxina en concentraciones de 100, 10, 1 y 0,1 ng / ml se preparan en un tampón de HCN. </li><li> Paralelos de las fracciones citosólica y orgánulos están preparados para un experimento de control para confirmar la fidelidad de los procedimiento de fraccionamiento. Fracciones generadas como se describe en la Sección 2 se resuspendió en 20 l de tampón de muestra de 4x (fracción citosólica) o 120 l de tampón de muestra 1x (fracción orgánulo). Volúmenes equivalentes de cada fracción se resolvieron por electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato de poliacrilamida y probaron by análisis de Western blot para demostrar la partición de una proteína citosólica en el sobrenadante y una proteína soluble, residente de ER en la fracción de pellets 16-19. </li></ol> 4. SPR preparación de los portaobjetos <ol><li> El refractómetro Reichert SR7000 SPR se usa para los experimentos de SPR. </li><li> Establecer un portaobjetos de vidrio dorado con una monocapa auto-ensambladas en el instrumento de SPR. Para activar el sensor de diapositivas, perfundir una relación 1:1 (v: v) de 0,4 M y 0,1 EDC NHS M sobre el portaobjetos durante 10 minutos con un caudal de 41 l / min. Todas las perfusiones siguientes utilizarán el mismo caudal. </li><li> Para quitar la EDC: tampón de activación del SNS, se lava la placa durante 5 min con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (PBST). La placa contiene ahora los amarres reactiva amida debido a destapar por la EDC: solución de NHS. </li><li> Perfundir un anticuerpo anti-CTA sobre la diapositiva activa el sensor a una dilución de 1:20.000 en acetato de sodio 20 mM (pH 5,5) durante 15 min. Una caída inicial de la refracción endex unidad (RIU) será visto por el cambio de pH. Esto será seguido por un aumento en el RIU, como el anticuerpo es capturado por las cuerdas amida-reactiva en la diapositiva sensor. </li><li> Eliminar el anticuerpo no unido a partir de la diapositiva del sensor con un lavado PBST 5 minutos. La señal producida por el RIU anticuerpos capturados se estabilizará y estabilizar, que proporciona una señal nueva línea de base. </li><li> Perfundir 1 M etanolamina (pH 8,5) sobre el portaobjetos sensor de 5 min. Este tapas e inactiva los amarres no unido a la izquierda en la diapositiva sensor. </li></ol> 5. SPR análisis de las muestras <ol><li> Para establecer una lectura de referencia, PBST perfundir sobre el sensor recubiertas de anticuerpos durante 5 min. </li><li> Perfundir una muestra experimental o estándar de la toxina sobre el sensor de 300 seg. Quitar el ligando del búfer y PBST perfundir sobre el sensor para otro sec 200. </li><li> Después de cada perfusión, la toxina se elimina obligado desde el sensor de un lavado de 100 segundos con PBST a pH 5,0. Esto devolverá la señalen su lectura inicial de referencia, permitiendo así que otra muestra que se procesa en el mismo sensor. </li><li> Antes de cargar una nueva muestra, empujar una pequeña cantidad de aire a través del bucle de muestra para expulsar el líquido residual de la muestra anterior. Utilizando el procedimiento descrito en 5.2 a 5.4, hemos llevado a cabo hasta 12 muestras en una diapositiva sin pérdida sustancial de la señal de referencia. </li><li> El análisis de datos se realiza con el Scrubber 2 software y el software de Igor se utiliza para la preparación de la figura. </li></ol> 6. Resultados representante La toxina pertussis (PT) es una toxina AB que se mueve de la superficie de la célula a la sala de emergencias antes de que una cadena (PTS1) entra en el citosol 3, 12. Como se muestra en la Figura 2, nuestro SPR-ensayo basado en la translocación podría detectar PTS1 en el citosol de las células CHO intoxicado. No hay señal fue generada desde el citosol de las células unintoxicated, que confirmó el anticuerpo anti-PTS1 no tienen reacción cruzada con un componente de la citosol de acogida. Lafracción citosólica de las células de embriaguez en la presencia de brefeldin A (BFA) también logró producir una señal positiva. BfA impide el transporte de toxinas en el sitio translocación ER 06.08, 12, 20-25 y, por tanto, una cadena de suministro para el citosol. Al final de cada carrera, la toxina obligado es despojado de la diapositiva del sensor. Esto permite múltiples muestras que se proyectarán en una diapositiva de un solo sensor y por lo tanto proporciona una comparación directa entre los resultados obtenidos con diferentes condiciones experimentales. CT es otro tipo AB, ER-translocación de la toxina 4. En la Figura 3A, CTA1 se detectó en la fracción citosólica de CT tratados con células HeLa. Esto puso de relieve que nuestra metodología funciona con múltiples tipos de células y se puede aplicar a cualquier toxina que un anti-anticuerpo de cadena A está disponible. No se detectó señal cuando la fracción citosólica de la CT-células tratadas fue perfundido en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB (Fig. 3B), lo que demuestra que la CTA1subunidad de la célula, pero no vinculante CTB pentámero entra en el citosol. Figura 3C muestra la señal de la fracción orgánulo está fuera de escala en comparación con la señal más débil de la fracción citosólica. Esto fue consistente con la ineficiencia de los CT conocidos de transporte al sitio de translocación ER 6, 7, que a su vez limita la cantidad de toxina que puede alcanzar el citosol. Por otra parte, la fracción organelo contiene holotoxina CT, así como ER-localizada CTA1, por lo que la señal resultante SPR para la fracción orgánulo está inflado por el peso adicional del pentámero holotoxina asociada CTB. Por lo tanto, no es práctico para representar gráficamente los datos de las fracciones citosólica y orgánulos en el sensorgram mismo. Nuestro ensayo se puede controlar la acumulación en función del tiempo de la toxina trasladadas, citosólica (Fig. 4). Las células fueron expuestas a la TC a 4 ° C, una temperatura que permita unión a la toxina a la membrana plasmática, pero impide la internalización de la toxina asociada a las células. Después de que el removalores de la toxina no consolidados, las células se calentaron a 37 º C. Tanto el transporte de toxinas a la sala de emergencia y un desplazamiento de la cadena hasta el citosol puede ocurrir a esta temperatura. No se detectó la toxina en el citosol de 15 minutos después del calentamiento a 37 º C. Esto refleja el tiempo de espera necesario para el tráfico de holotoxina (i) a la sala de emergencias, (ii) A / disociación subunidad B de la sala de emergencia, y (iii) Una cadena de exportación al citosol. Un grupo de menores de la toxina citosólica se detectó después de 30 minutos a 37 ° C, y las cantidades cada vez mayores de la toxina citosólica se detectaron después de los 45 y 60 minutos de intervalo persecución. Mayores niveles de toxina citosólica se detectaron después de un intervalo de 5 horas 17 persecución, lo que demuestra un continuo, a largo plazo de entrega de células asociadas a la toxina en el citosol de acogida. Nuestro análisis también puede detectar la inhibición de la translocación de la toxina en el citosol (Fig. 5). Las células tratadas con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), un acompañante químico que impide la trast térmicaEring de los aislados CTA1 subunidad (T. Banerjee y Teter K., observaciones no publicadas), mostraron bajos niveles de CTA1 citosólica en comparación con las células control sin tratar. Desarrollo de la toxina de la cadena es un requisito previo para la translocación al citosol 16-18, por lo que la estabilización de DMSO inducida de CTA1 en consecuencia impide su traslado desde la sala de emergencias en el citosol. La tasa constante de asociación (k a) calculado a partir de experimentos de SPR es directamente proporcional a la concentración del ligando en el buffer de la perfusión de 14, 15, 26. Por lo tanto, es posible determinar la concentración citosólica de la toxina de un gráfico que representa los valores de k una de las normas de la toxina en función de la concentración de toxinas. Este procedimiento se utilizó para cuantificar el bloque de DMSO inducida por la translocación de la toxina se presenta en la Figura 5: la curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de la toxina se utilizó para calcular una citosólica concen CTA1ion de 0,3 ng / ml para las células no tratadas y 0,1 ng / mL de DMSO células tratadas (Fig. 6). La inhibición de la CTA1 desarrollo de DMSO por lo tanto genera una reducción de 3 veces en la translocación de ER-a-citosol de CTA1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> Figura 1. Descripción general del protocolo. (A) Las células se incubaron con la toxina AB a 4 ° C, una temperatura que permita la toxina unión a la superficie celular, pero evita que la endocitosis de toxinas. Las subunidades A y B de la toxina están representados por círculos rojos y azules, respectivamente. (B) Sin consolidar, la toxina se elimina de la media, y las células se calientan a 37 ° C con el fin de promover el transporte retrógrado de la endocitosis y la holotoxina a la sala de emergencias. Holotoxina disociación ocurre en la sala de emergencias, que permite que el aislado una cadena para entrar en el citosol por la que pasa a través de un canal proteico-realización (s) en la membrana del ER. (C) Las células se tratan con digitonina con el fin de permeabilizar selectivamente el plasmamembrana. (D) La centrifugación se utiliza para dividir las células en distintas fracciones citosólica y orgánulos. El citosol es expulsado de la célula a través de los poros digitonina generado y se encuentra en el sobrenadante. El intacta, unidas a la membrana orgánulos se encuentran en la fracción de pellets. (E) Para detectar la piscina trasladadas de la toxina de la cadena en el citosol de acogida, la fracción sobrenadante se perfunde en un sensor de SPR recubierto con un anticuerpo anti-A de la cadena. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> Figura 2. Detección de PTS1 translocación en el citosol de acogida. Las células CHO se pulso-marcados a 4 º C durante 30 minutos con 1 mg / ml de PT. Las células fueron perseguidos después de 3 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y fracti citosólicaComplementos. Un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-PTS1 se utilizó para detectar la piscina citosólica de PTS1 de las células no tratadas o tratadas BfA. PTS1 normas fueron perfundidos en el sensor como controles positivos, mientras que la fracción citosólica de las células unintoxicated fue perfundido sobre la diapositiva sensor como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> Figura 3. Detección de CTA1 translocación en el citosol de acogida. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y las fracciones citosólica. (A) Las fracciones citosólicas fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Conocidocantidades de CTA se utilizaron como controles positivos, mientras que el citosol de las células unintoxicated se utilizó como control negativo. (B) La fracción citosólica de las células de embriaguez en la ausencia de BfA se perfundió sobre un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB. A purificada CTB pentámero se perfundió sobre la diapositiva como un control positivo. (C) La fracción orgánulo se solubilizó con 1% de Triton X-100 antes de la perfusión en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. A efectos comparativos, la fracción citosólica (1 ml de volumen final) a partir del extracto misma celda y un estándar de CTA fueron perfundidos también sobre el sensor. Para todos los paneles, la muestra unida se despojó del sensor al final de cada carrera. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> Figura 4. Cinética de CTA1 entrada en el citosol. Células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 15, 30, 45 o 60 min a 37 ° C en el libre de toxinas medium. Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA fueron perfundidos en el sensor también. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> Figura 5. La inhibición de la translocación de CTA1 DMSO. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o DMSO al 10% (+ DMSO intoxicado). Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA (100, 10, 1 y 0,1 ng / ml) fueron perfundidos en el sensor como controles positivos y sólo el 1 y 0,1 ng / mL normas se muestra para fines de escala. El citosol de unintoxicated células se utilizó como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> Figura 6. Cálculo de citosólicas CTA1. K uno de los valores de los estándares de la CTA en la Figura 5 se representa en función de la concentración de la toxina. La curva resultante estándar se utilizó para determinar, en base a los valores de k una de las muestras experimentales de la Figura 5, la concentración citosólica de CTA1 en las células sin tratar y tratados con DMSO. Normas de la toxina se presentan como círculos rellenos; el citosol sin tratar se presenta como una plaza abierta, y el citosol tratado con DMSO se presenta como un círculo abierto. Los promedios ± intervalos de dos experimentos independientes se muestran.

No hay conflictos de interés declarado.

Comparación con la metodología vigente Nuestra SPR-ensayo basado en la translocación representa un método rápido, sensible y cuantitativo para detectar la entrega toxina en el citosol de acogida. La técnica no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina, y puede ser aplicado a cualquier toxina que un anti-toxina anticuerpo de cadena está disponible. Los métodos existentes para controlar el paso de toxinas en el citosol también se basan en un protocolo de fraccionami...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Digitonina </td><td> Sigma </td><td> D141 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Acros </td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995065 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Atlanta Productos Biológicos </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Gangliósido GM1 </td><td> Sigma </td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td> Sigma </td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td> Lista </td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS (N-hidroxisuccinimida) </td><td> Atravesar </td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22981 </td></tr><tr><td> Etanolamina </td><td> SiGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td> Medicago </td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td> Anti-CTA anticuerpos </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-80747 </td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-CTB </td><td> Calbiochem </td><td> 227040 </td></tr><tr><td> Anticuerpos anti-PTS1 </td><td> Santa Cruz Biotech </td><td> sc-57639 </td></tr><tr><td> Refractómetro </td><td> Reichert </td><td> SR7000, SR7000DC </td></tr><tr><td> SPR sensor de diapositivas </td><td> Reichert </td><td> 13206060 </td></tr><tr><td> Jeringa de la bomba </td><td> Cole Palmer </td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

detection of toxin translocation into the host cytosol by surface plasmon resonance

Toxinas AB consisten en una subunidad enzimática y una subunidad de unión celular B 1. Estas toxinas son secretadas en el medio extracelular, sino que actúan sobre los objetivos en el citosol eucariota. Algunas toxinas AB viaje por las compañías de vesículas en la superficie celular en el retículo endoplásmico (RE) antes de entrar en el citosol 2-4. En la sala de emergencias, el catalizador se disocia una cadena del resto de la toxina y se mueve a través de un canal proteico-llevar a cabo para alcanzar su objetivo citosólico 5. La translocación, citosólica Una cadena es difícil de detectar porque el tráfico de la toxina a la sala de emergencia es un proceso extremadamente ineficiente: la toxina más interiorizado se dirige a los lisosomas para la degradación, por lo que sólo una pequeña fracción de la superficie con destino toxina alcanza el aparato de Golgi y RE 6 -12. Para controlar la translocación de la toxina de la sala de emergencias para el citosol de las células en cultivo, se combinó un protocolo de fraccionamiento subcelular con los highly método de detección sensible de resonancia de plasmones superficiales (SPR) 13-15. La membrana plasmática de las células de toxinas es tratada de forma selectiva permeabilizadas con digitonina, logrando la recolección de una fracción citosólica, que posteriormente se perfunde en un sensor de SPR recubierto con una toxina anti-un anticuerpo de cadena. El sensor recubiertas de anticuerpos puede capturar y detectar pg / mL cantidades de la toxina del citosol. Con este protocolo, es posible seguir la cinética de entrada de la toxina en el citosol y caracterizar los efectos inhibitorios en el caso de desplazamiento. La concentración citosólica de la toxina también puede ser calculada a partir de una curva estándar generada con cantidades conocidas de una cadena de normas que han sido perfundidos sobre el sensor. Nuestro método consiste en un sistema rápido, detección sensible, cuantitativa y que no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina de destino.

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Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

detection-toxin-translocation-into-host-cytosol-surface-plasmon

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.2K vistas.  University of Central Florida. En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

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Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Detección del virus infeccioso de campo recogidos por los mosquitos del ensayo cultivo celular Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

La detección de la aspergilosis pulmonar invasiva en pacientes con neoplasia hematológica maligna, mediante el uso de la tecnología de flujo lateral

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

Detección de<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant glicoproteína de superficie de conmutación por Magnetic Activated Cell Sorting y Citometría de Flujo

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

Detección de la colonización de Escherichia Coli enterohemorrágica en anfitrión murino no invasiva In Vivo el sistema de bioluminiscencia

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Una plataforma de alto rendimiento para la detección de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Evaluación de las respuestas del huésped-patógeno y eficacia de la vacuna en ratones

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...