Abbiamo sviluppato un metodo semplice per testare campioni di alimenti per i diversi tossinetipi di C perfringens. Siamo particolarmente interessati alla prevalenza di tossinotipi B e D che producono la tossina epsilon. Il nostro protocollo consente un facile arricchimento e rilevamento dei vari tossinotipi di C perfringens senza l'uso di camere anaerobiche o incubatori con sotto-coltivazione limitata.
Questo metodo potrebbe anche essere usato per testare terreno, acqua, campioni fecali e altro ancora. A dimostrare la procedura saranno Zuha Anwar e Samantha Regan, tecnici del laboratorio. Iniziare preparando il mezzo perfringens rapido modificato o rpm.
Combinare gli ingredienti in base alle indicazioni del manoscritto e autoclavare la miscela a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare raffreddare il mezzo a circa 40 gradi Celsius, quindi aggiungere D-ciclocilerina a una concentrazione finale di 440 milligrammi per litro. Trasferire aseticamente l'RPM a tubi conici da 15 millilitri e conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese.
Prima dell'uso, riscaldare il mezzo a 37 gradi Celsius. Quando si raccolgono campioni da testare, trasferire il cibo in laboratorio secondo le indicazioni manoscritte. Se non si testa immediatamente, il cibo può essere conservato a meno 20 gradi Celsius.
Prendere nota del tipo di cibo e del paese di origine, nonché di qualsiasi altra informazione pertinente. Per testare il cibo, trasferire circa uno o due grammi in una piastra di Petri sterile e tritarlo finemente con una lama di rasoio sterile o bisturi. Inocularlo in 10 millilitri di PBS in un tubo conico da 15 millilitri e mescolare bene.
Selezionare per le cellule vegetative trasferendo cinque millilitri della miscela alimentare PBS in un tubo conico da 15 millilitri con 10 millilitri di RPM e chiudendo saldamente il coperchio. Selezionare per le spore riscaldando i restanti cinque millilitri della miscela a 85 gradi Celsius per 15 minuti. E poi trasferirlo su un tubo con RPM e chiudere saldamente il coperchio.
Per garantire la miscelazione completa, vortice e invertire le colture di giri/min alimentari. Quindi, sigillare saldamente i tubi conici e avvolgere i coperchi con pellicola di paraffina per creare un ambiente anaerobico. Incubare i tubi durante la notte a 37 gradi Celsius e notare qualsiasi torbidità o fermentazione la mattina seguente.
Preparare il triptosio Sulfite Cycloserine o TSC Agar secondo la direzione del produttore, quindi utilizzare la tecnica sandwich per inocularlo con colture RPM durante la notte. Preparare lo strato base delle piastre trasferendo 10 millilitri dell'Agar fuso a piastre di Petrie sterili e permettendogli di solidificarsi. Mantenere il rimanente Agar TSC a 40 gradi Celsius per lo strato superiore e trasferire con cura 100 microlitri della coltura RPM notturna alla base di Agar.
Alcune colture possono essere sotto pressione a causa della fermentazione, quindi assicurati di indossare tutti i dispositivi di protezione individuale appropriati. Stendere l'inoculina con perline di vetro sterili o uno spargitore di cellule e consentire l'assorbimento di RPM nell'Agar per cinque-10 minuti. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire con cura 20 millilitri dell'Agar TSC fuso sulla piastra.
Sostituire il coperchio della piastra di Petrie e consentire a TSC Agar di solidificarsi completamente a temperatura ambiente, quindi invertire la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius durante la notte. Se necessario, eseguire diluizioni seriali delle impostazioni cultura RPM prima dell'inoculazione in TSC Agar. Dopo l'incubazione, esaminare le piastre per la crescita batterica.
I batteri aerobici possono essere presenti sulla superficie dell'Agar, mentre i batteri anaerobici saranno incorporati nell'Agar. I batteri riducenti del solfito diventano neri l'Agar circostante e le possibili colonie di perfringens C saranno nere e incorporate nell'Agar. Se c'è una densa quantità di crescita batterica aerobica sulla superficie della piastra, utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le colonie da aree selezionate.
Utilizzare un contagocce monouso sterile per strappare le colonie di perfringen C sospette dall'Agar, assicurandosi di espellere l'aria prima di perforare l'Agar. Trasferire le colonie a 10 millilitri di rpm fresco in un tubo conico da 15 millilitri. Più colonie potrebbero essere campionare dalla stessa piastra in colture RPM separate.
Fissare saldamente i coperchi del tubo conico, avvolgerli in pellicola di paraffina e incubarli durante la notte a 37 gradi Celsius. C perfringens è un organismo BSL a due. È importante utilizzare in ogni momento le corrette precauzioni di sicurezza, specialmente quando si aprono colture di giri/min durante la notte e decontaminare e smaltire con cura i mezzi usati.
Il giorno successivo, rimuovere le colture notturne ed esaminarle per la torbidità e la fermentazione, quindi procedere con l'estrazione del DNA. Invertire delicatamente la coltura rpm per disperdere eventuali batteri sistemati e aprire con cura il tubo. Trasferire un millilitro in un tubo di microcentrifugo e pelletare i batteri mediante centrifugazione.
Lavare il pellet con un millilitro di PBS sterile. Se la gelatina non digerita si è depositata sopra i batteri, lanugine agitando con PBS. Aspirare delicatamente la gelatina e il PBS e sospendere di nuovo il pellet batterico rimanente con un millilitro di PBS fresco.
È importante rimuovere qualsiasi gelatina pelletata con un disturbo limitato del pellet cellulare. La mancata rimozione della gelatina può inibire l'estrazione del DNA e la PCR. Centrifugare i batteri per 10 minuti e aspirare con cura il supernatante.
Quindi eseguire l'estrazione del DNA utilizzando un kit appositamente progettato per i batteri gram positivi. Usa immediatamente il DNA o conservalo a meno 20 gradi Celsius. Eseguire la PCR sul DNA estratto per determinare se le colture sono positive per i tossinotipi di C perfringens.
Utilizzare il DNA di C perfringens come controllo positivo per garantire che tutti i reagenti PCR funzionino. Eseguire la PCR secondo le indicazioni manoscritte e analizzare i prodotti con elettroforesi in gel di agarosio. Questo protocollo è stato utilizzato per testare un totale di 216 campioni di cibo acquistati dai negozi al dettaglio di New York.
I campioni includevano vari campioni di carne, campioni di pollame e campioni di frutti di mare. C perfringens Tipo B è stato utilizzato come controllo positivo. Si è riscontrato che il 15-20% degli alimenti campionati è positivo al test per i perfringens C.
Dei 34 campioni positivi, 31 campioni contenevano la tossina alfa, un campione conteneva la tossina alfa, beta ed epsilon. E due campioni contenevano la tossina alfa ed epsilon. Abbiamo sviluppato un metodo semplice per testare campioni di alimenti per i diversi tossinetipi di C perfringens.
Siamo particolarmente interessati alla prevalenza di tossinotipi B e D che producono la tossina epsilon.
