El uso de la litografía de haz iónico focalizado, o FIB, permite a los investigadores mejorar la interacción de la superficie celular mediante el diseño de superficies de materiales que han aumentado la biocompatibilidad y la integración con el tejido nativo. Con FIB, las características se pueden grabar en una variedad de materiales, como silicio, metales y polímeros. También se pueden utilizar superficies no planas y se puede realizar el postprocesamiento en dispositivos individuales.
En general, este método se puede utilizar en otros microscopios. Sin embargo, los diferentes fabricantes de microscopios tienen versiones únicas del software de modelado, que debe optimizarse para cada sistema. Shreya Mahajan,una estudiante graduada de mi laboratorio.
Para prepararse para el montaje, utilice fórceps de vacío de diámetro de punta fina para recoger cuidadosamente la tira limpia de sondas de silicio. Colóquelos en un talón de aluminio limpio utilizado para escanear imágenes y grabados FIB del microscopio electrónico. Utilice un palillo de dientes para colocar una pequeña gota de pintura plateada en el borde del sustrato de silicio que rodea la sonda.
Asegure la tira extendiendo la pintura plateada alrededor de los lados del sustrato de silicio que rodea la sonda. Deje que la pintura plateada se seque completamente antes de colocar el talón de aluminio en el SEM FIB. A continuación, haga clic en el botón Ventilación en la pestaña Control de viga para ventilar la cámara SEM FIB.
Pulse Mayús F3 para realizar la fase de inicio. Confirme la selección seleccionando el botón Inicio del escenario en la ventana emergente. Una vez completada la etapa de inicio, mueva la etapa a las coordenadas X-70 milímetros, Y-70 milímetros, Z-0 milímetros, T-0 grados, R-0 grados.
Una vez ventilada la cámara, póngase guantes de nitrilo limpios y abra la puerta de la cámara. Inserte el talón de aluminio que sujeta las sondas en la parte superior del adaptador de escenario. Asegure el talón de aluminio apretando el tornillo de ajuste en el lado del adaptador de escenario.
Asegúrese de que la altura se ajusta adecuadamente. Utilice la llave hexagonal de 1,5 milímetros para esta tarea. Abra cuidadosamente el brazo de la cámara de navegación hasta que se detenga.
La etapa del microscopio se moverá automáticamente a una posición debajo de la cámara. Vea la imagen en vivo que se muestra en el cuadrante tres de la interfaz de usuario del microscopio. Una vez que el nivel de brillo se ajuste automáticamente a un nivel adecuado, adquiera la imagen presionando el botón hacia abajo en el soporte de la cámara.
Esto toma aproximadamente 10 segundos. Gire el brazo de la cámara de nuevo a la posición cerrada. El escenario volverá a la posición original.
Cierre cuidadosamente la puerta de la cámara del microscopio. Observe la imagen de la cámara CCD en el cuadrante cuatro mientras cierra la puerta. Asegúrese de que las muestras y la etapa estén a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio.
Seleccione el botón Bomba con limpieza de muestras en el software de interfaz de usuario para iniciar la bomba de vacío de la cámara y el limpiador de plasma incorporado. Espere aproximadamente ocho minutos para que se complete el tiempo de bombeo y el ciclo de limpieza del plasma de la cámara del microscopio. Una vez que el icono en la esquina inferior derecha de la interfaz de usuario se vuelve verde, presione el botón Despertar en la pestaña de control del haz que enciende los haces de electrones e iones.
Seleccione Cuadrante Uno y establezca la señal de haz en Rayo de electrones. A continuación, establezca cuadrante dos en viga de iones. Ahora, ajuste el voltaje SEM a cinco kilovoltas, la corriente de haz SEM en 0,20 nanoamps, el detector SEM en ETD y el modo detector en electrones secundarios.
Establezca el voltaje FIB en 30 kilovoltas, el haz FIB en 24 picoamps, el detector FIB en detector ICE y el modo detector en el electron secundario. Haga doble clic en la sonda de silicio en la imagen de la cámara de navegación, Cuadrante Tres para mover el escenario a la ubicación aproximada de la sonda. Haga clic en Cuadrante Uno para seleccionarlo como el cuadrante activo y pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo SEM.
Establezca el tiempo de permanencia del análisis en 300 nanosegundos y desactive Escancer entrelazado, Integración de línea y Promedio de fotogramas. Establezca Rotación de escaneado en cero en la pestaña Control de viga. Haga clic con el botón derecho en el Ajustador 2D de Cambio de viga y seleccione cero.
Ajuste la ampliación al valor mínimo girando la perilla de ampliación en sentido antihorario en el panel de interfaz de usuario del microscopio. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen utilizando las perillas del panel de la interfaz de usuario o el icono de la barra de herramientas de brillo de contraste automático. Mueva el escenario haciendo doble clic izquierdo haciendo clic con el ratón sobre una operación para centrarla.
A continuación, mueva la sonda de silicio deseada para que se estame en el centro de la imagen SEM. Localice una arista u otra operación, como una partícula de polvo o un rasguño. Aumente el aumento a 2000x girando la perilla de aumento en el sentido de las agujas del reloj.
Ajuste el enfoque del SEM girando las perillas de enfoque grueso y fino en la interfaz de usuario del microscopio, hasta que la imagen esté enfocada. Una vez que la imagen esté enfocada, seleccione el botón Vincular muestra Z a distancia de trabajo en la barra de herramientas. Confirme que la operación se ha completado mirando la coordenada del eje Z en la pestaña de navegación.
El valor debe ser de aproximadamente 11 milímetros. Escriba 4,0 milímetros en la posición del eje Z y pulse el botón Ir a con el ratón. Mueva el escenario en X e Y para localizar el hombro de la sonda de silicio.
Coló ello lo más cerca posible del centro del SEM. Cambie la inclinación del escenario a 52 grados escribiendo 52 en la coordenada T y pulsando Intro. Observe si el hombro de la sonda parece moverse hacia arriba o hacia abajo en la imagen.
Utilice el control deslizante Etapa Z para volver a poner el hombro de la sonda en el centro de la imagen SEM. Ajuste únicamente la posición Z. No mueva los ejes X, Y, T o R.
Ejecute la función de alineación XT integrada, ubicada en el menú desplegable del escenario. Utilice el ratón para hacer clic en dos puntos paralelos al borde de la sonda. Mae asegúrese de que el botón de opción horizontal está seleccionado en la ventana emergente y haga clic en Finalizar.
El escenario girará para alinear la sonda con el eje X del escenario. Ajuste el escenario en XY utilizando el ratón para volver a colocar el hombro inferior de la sonda en el centro de la imagen SEM. Seleccione la BOLA en el Cuadrante Dos y asegúrese de que la corriente de la viga sigue siendo de 24 picoamps.
Establezca el aumento en 5000X y el tiempo de permanencia en 100 nanosegundos. Escriba Control-F en el teclado para establecer el enfoque FIB en 13 milímetros. En la pestaña Control de viga, haga clic con el botón derecho en el ajustador 2D de Estigmator y seleccione cero.
Además, haga clic con el botón derecho en el ajustador 2D de Beam Shift y seleccione cero. Establezca la rotación del escaneo en cero grados y haga clic en el botón de brillo de contraste automático en la barra de herramientas. Busque una imagen del hombro de la sonda en el Cuadrante Dos.
Utilice la herramienta de instantáneas para adquirir una imagen en la FIB. Confirme que el hombro de la sonda está en el centro de la imagen FIB. Si no es así, haga doble clic en el hombro de la sonda para moverlo al centro.
Mueva el escenario a la izquierda presionando la tecla de flecha izquierda en el teclado aproximadamente 10 a 15 veces. Tome otra instantánea y observe si el lado de la sonda todavía está en el centro de la BOLA. Después de repetir estos pasos hasta que el borde del hombro de la sonda esté perfectamente alineado con el eje X de la etapa, utilice la BOLA para mover la etapa de nuevo al hombro inferior de la sonda.
Guarde la posición de la etapa en la lista de posiciones haciendo clic en el botón Agregar. Cambie la corriente del haz FIB a 2,5 nanoamps y asegúrese de que el aumento de la BOLA sigue siendo 5000X. Ejecute la función de contraste de brillo automático y establezca el tiempo de permanencia de la BOLA en 100 nanosegundos.
Pulse el botón de pausa para iniciar el escaneo. Ajuste el enfoque y el astigmatismo DE la FIB de la forma más rápida y precisa posible utilizando las perillas de enfoque grueso y fino y las perillas del estigmator X e Y en el panel de interfaz de usuario. Pulse el botón de pausa para detener el escaneo de la FIB.
Dentro del software Nanobuilder, abra el archivo para Patterning the Silicon Probes. Seleccione el menú desplegable Microscopio y seleccione Establecer origen de etapa. Seleccione el menú desplegable Microscopio y, a continuación, seleccione Calibrar detectores.
En la interfaz de usuario del microscopio, haga clic en Quad One una vez con el ratón para seleccionar Quad One. Haga clic en Aceptar para iniciar la calibración. El proceso tardará unos cinco minutos.
Asegúrese de que los detectores ETD e ICE se calibran. En el software, seleccione el menú desplegable Microscopio y elija Ejecutar para iniciar la secuencia de patrones. Cuando el patrón esté completo, cierre el software.
Pulse Ventilación en la pestaña Control de haz de la interfaz de usuario del microscopio para apagar los haces del microscopio e iniciar el ciclo de ventilación. Mientras la cámara se está ventilando, mueva el escenario a las coordenadas adecuadas. Una vez ventilada la cámara, póngase guantes de nitrilo limpios y abra la puerta de la cámara.
Afloje el tornillo de fijación en el adaptador de talón con la llave hexagonal de 1,5 milímetros. Retire el talón de aluminio que contiene la sonda estanada de la cámara. Cierre cuidadosamente la puerta de la cámara del microscopio.
Observe la imagen de la cámara CCD en el cuadrante cuatro mientras cierra la puerta. Asegúrese de que el adaptador de etapa esté a una distancia segura de cualquier componente crítico de la cámara del microscopio. Aquí se muestran imágenes SEM de las sondas de silicio de un solo vástago no funcionales con nanoarquitecturas grabadas en FIB a lo largo de la parte posterior del vástago.
Las dimensiones finales de la nanoarquitectura grabada eran líneas paralelas de 200 nanómetros de ancho separadas por 300 nanómetros y con una profundidad de 200 nanómetros. Para determinar cómo el grabado de nanoarquitecturas en la superficie de la sonda afecta a la densidad neuronal inmediatamente alrededor del implante, los nucleii neuronales fueron manchados y cuantificados. La supervivencia neuronal se presenta como un porcentaje de la región de fondo de las mismas distancias de animales de 50 contenedores de micras de distancia del sitio del implante.
Había significativamente más neuronas alrededor de las sondas de nanoarquitectura a distancias de 100 a 150 micras del sitio del implante en comparación con los implantes de control suave a las cuatro semanas después de la implantación. Las nanoarquitecturas también fueron grabadas a lo largo de la parte posterior de los microelectrodos funcionales de silicio de un solo vástago y se cuantificaron las mediciones electrofisiológicas para investigar cómo las nanoarquitecturas de grabado afectan el rendimiento de los electrodos. Los resultados electrofisiológicos mostraron mayores porcentajes de canales que registran unidades individuales a partir de los microelectrodos de nanoarquitectura en comparación con los microelectrodos de control suave.
No se realizó ningún análisis estadístico para el microelectrodo de nanoarquitectura porque solo se implantó uno para un estudio piloto de prueba de concepto. El grabado FIB permite a los investigadores investigar cómo la adición de señales topográficas en dispositivos médicos puede mejorar la respuesta celular y, en última instancia, el rendimiento del dispositivo. La amplitud de los dispositivos médicos a los que se pueden aplicar estos métodos es ilimitada, ya que la BOLA se puede realizar en una gama de materiales, geometrías de superficie y, lo que es más importante, dispositivos ya fabricados.
