Использование сфокусированной литографии ионного луча, или FIB, позволяет исследователям улучшить взаимодействие поверхности клетки путем конструировать материальные поверхности которые увеличивали биосовместимость и интеграцию с родной тканью. С FIB функции могут быть выгравированы на различных материалах, таких как кремний, металлы и полимеры. Неплантарные поверхности также могут быть использованы и после обработки могут быть выполнены на отдельных устройствах.
В общем, этот метод можно использовать и на других микроскопах. Тем не менее, различные производители микроскопов имеют уникальные версии шаблонного программного обеспечения, которое должно быть оптимизировано для каждой системы. Демонстрацией процедуры будет мисс Шрея Махаджан, аспирантка моей лаборатории.
Чтобы подготовиться к монтажу, используйте мелко опрокинутые вакуумные типсы, чтобы тщательно подобрать чистую полоску кремниевых зондов. Поместите их на чистую алюминиевую заглушку, используемую для сканирования изображения и офорта электронного микроскопа FIB. Используйте зубочистку, чтобы поместить крошечную каплю серебряной краски на краю кремниевого субстрата, окружающего зонд.
Защитите полосу, распространяя серебряную краску по бокам кремниевого субстрата, окружающего зонд. Разрешить серебряную краску, чтобы высохнуть полностью перед размещением алюминиевой заглушки в SEM FIB. Затем нажмите на кнопку Vent во вкладке Beam Control, чтобы выпустить камеру SEM FIB.
Нажмите Shift F3 для выполнения домашней сцене. Подтвердите выбор, выбрав кнопку Home Stage во всплывающем окне. После завершения домашнего этапа перемести сцену на координаты X-70 миллиметров, Y-70 миллиметров, 0 миллиметров, T-0 градусов, R-0 градусов.
После того, как камера вентилируемые, надеть чистые перчатки nitrile и открыть дверь камеры. Вставьте алюминиевую заглушку, удерживавую зонды в верхней части адаптера сцены. Закрекрет алюминиевую заглушку, затягивая установленный винт на стороне адаптера сцены.
Убедитесь, что высота регулируется соответствующим образом. Используйте 1,5-миллиметровый шестиугольный ключ для этой задачи. Аккуратно распахнуть руку навигационной камеры до тех пор, пока она не остановится.
Стадия микроскопа автоматически переходит в положение под камерой. Посмотрите живое изображение, показанное в квадранте 3 пользовательского интерфейса микроскопа. После того, как уровень яркости автоматически настраивается на соответствующий уровень, приобрести изображение, нажав кнопку вниз на камеру кронштейн.
Это занимает около 10 секунд. Качели камеры руку обратно в закрытое положение. Этап вернется в исходное положение.
Аккуратно закройте дверь камеры микроскопа. Смотрите изображение камеры CCD в квадранте четыре, закрывая дверь. Убедитесь, что образцы и сцена находятся на безопасном расстоянии от любого важного компонента в камере микроскопа.
Выберите насос с кнопкой очистки образцов в программном обеспечении пользовательского интерфейса, чтобы начать вакуумный насос камеры и встроенный плазменный очиститель. Подождите около восьми минут для откачки времени и плазмы очистки цикла микроскопа камеры, которая будет завершена. Как только значок в правом нижнем углу пользовательского интерфейса станет зеленым, нажмите кнопку Wake Up во вкладке управления лучом, которая включает электронные и ионные лучи.
Выберите квадрант один и установите сигнал луча на электронный луч. Затем установите квадрант два ионные балки. Теперь установите напряжение SEM до пяти киловольт, ток луча SEM до 0,20 наноампер, детектор SEM для ETD и режим детектора для вторичных электронов.
Установите напряжение FIB до 30 киловольт, луч FIB до 24 пикоамперов, детектор FIB для детектора ICE и режим детектора для вторичного электрона. Двойное нажатие на кремниевый зонд на изображении навигационной камеры, квадрант три, чтобы переместить сцену к приблизительному расположению зонда. Нажмите на квадрант один, чтобы выбрать его в качестве активного квадранта и нажмите кнопку паузы, чтобы начать сканирование SEM.
Установите время сканирования до 300 наносекунд и выключите сканирование переплетения, интеграции линий и усреднения кадров. Установите вращение сканирования до нуля во вкладке Управления лучами. Нажмите правой кнопкой мыши на 2D-регулятор Beam Shift и выберите ноль.
Отрегулируйте увеличение до минимального значения, повернув ручку увеличения против часовой стрелки на панели пользовательского интерфейса микроскопа. Отрегулируйте яркость изображения и контрастность с помощью ручек на панели пользовательского интерфейса или значка панели инструментов автоконтрастной яркости. Переместите сцену двойным левым нажатием мыши на функцию, чтобы центр ее.
Затем переместите нужный кремниевый зонд в центр изображения SEM. Найдите край или другую функцию, например частицу пыли или царапину. Увеличьте увеличение до 2000x, повернув ручку увеличения по часовой стрелке.
Отрегулируйте фокус SEM, повернув грубые и тонкие ручки фокусировки на пользовательский интерфейс микроскопа, пока изображение не будет в фокусе. После того, как изображение находится в фокусе, выберите образец Link - кнопку рабочего расстояния в панели инструментов. Подтвердите, что операция была завершена, посмотреть на координаты оси в вкладке навигации.
Значение должно быть около 11 миллиметров. Ввеспользуйте 4,0 миллиметра в положении оси и нажмите кнопку Go To с помощью мыши. Переместив сцену в X и Y, чтобы найти плечо кремниевого зонда.
Распоив его как можно ближе к центру SEM. Измените наклон стадии до 52 градусов, введя 52 в координатах T и нажав Enter. Наблюдайте за тем, двигается ли плечо зонда вверх или вниз на изображении.
Используйте ползунок Stage, чтобы вернуть плечо зонда в центр изображения SEM. Только отрегулируйте положение q. Не двигайте оси X, Y, T или R.
Запустите встроенную функцию выравнивания XT, расположенную в меню высадки сцены. Используйте мышь, чтобы нажать на две точки параллельно краю зонда. Мэй уверена, что горизонтальная кнопка радио выбрана во всплывающем окне и нажмите Finish.
Этап будет вращаться, чтобы выровнять зонд с X-оси сцены. Отрегулируйте этап в XY с помощью мыши, чтобы положить нижнее плечо зонда в центре изображения SEM снова. Выберите FIB во второй квадранте и убедитесь, что ток луча по-прежнему 24 пикоампов.
Установите увеличение до 5000X и время обитения до 100 наносекунд. Тип Control-F на клавиатуре, чтобы установить фокус FIB до 13 миллиметров. Во вкладке Beam Control нажмите правой кнопкой мыши в 2D-регуляторе Stigmator и выберите ноль.
Кроме того, нажмите правой кнопкой мыши в регуляторе Beam Shift 2D и выберите ноль. Установите вращение сканирования до нуля градусов и нажмите кнопку автоконтрастной яркости в панели инструментов. Ищите изображение плеча зонда во второй квадранте.
Используйте инструмент моментального снимка для получения изображения в FIB. Подтвердите, что плечо зонда находится в центре изображения FIB. Если нет, дважды нажмите на плечо зонда, чтобы переместить его в центр.
Переместите сцену влево, нажав клавишу левой стрелки на клавиатуре примерно от 10 до 15 раз. Сделайте еще один снимок и наблюдайте, находится ли сторона зонда в центре FIB. После повторения этих шагов до тех пор, пока край плеча зонда не будет идеально выровнен с X-оси сцены, используйте FIB, чтобы переместить этап обратно в нижнее плечо зонда.
Сохраните положение сцены в списке позиций, нажав кнопку Добавить. Измените ток пучка FIB до 2,5 наноампер и убедитесь, что увеличение FIB по-прежнему 5000X. Запустите функцию контрастности авто-яркости и установите время обитаемого времени FIB до 100 наносекунд.
Навейте кнопку паузы, чтобы начать сканирование. Отрегулируйте фокус FIB и астигматизм как можно быстрее и точнее, используя грубые и тонкие ручки фокусировки и ручки X и Y stigmator на панели пользовательского интерфейса. Хит кнопку паузы, чтобы остановить сканирование FIB.
В программном обеспечении Nanobuilder откройте файл для шаблонирования кремниевых зондов. Выберите меню высадки микроскопа и выберите Set Stage Origin. Выберите меню высадки микроскопа, а затем выберите калибровочные детекторы.
На пользовательском интерфейсе микроскопа нажмите на четырехъядерный один раз с помощью мыши, чтобы выбрать Квад Один. Нажмите OK, чтобы начать калибровку. Процесс займет около пяти минут.
Убедитесь, что детекторы ETD и ICE калибруются. В программном обеспечении выберите меню высадки микроскопа и выберите Execute для запуска последовательности шаблонов. Когда шаблон будет завершен, закройте программное обеспечение.
Хит Вент в микроскоп пользовательского интерфейса Beam Control вкладку, чтобы закрыть микроскоп пучки и начать цикл вентиляции. Пока камера вентиляции, переместить сцену в подходящие координаты. После того, как камера вентилируемые, надеть чистые перчатки нитрила и открыть дверь камеры.
Расслабьте установленный винт на адаптере заглушки с помощью шестиугольного ключа диаметром 1,5 миллиметра. Удалите алюминиевую заглушку, содержащую узорчатый зонд, из камеры. Аккуратно закройте дверь камеры микроскопа.
Смотрите изображение камеры CCD в квадранте четыре, закрывая дверь. Убедитесь, что сценический адаптер находится на безопасном расстоянии от любого важного компонента в камере микроскопа. Здесь показаны SEM изображения нефункциональных одношенков кремниевых зондов с FIB-травленными нано-архитектурами вдоль задней стороны хвостовика.
Окончательные размеры выгравированной нано-архитектуры были 200 нанометров в ширину параллельных линий, размечах 300 нанометров друг от друга и имели глубину 200 нанометров. Чтобы определить, как офорт нано-архитектуры на поверхности зонда влияет на плотность нейронов непосредственно вокруг имплантата, нейронные ядра были окрашены и количественно. Нейронное выживание представлено в процентах от фоновой области от тех же животных расстояния 50 микрон бункеров от места имплантата.
Было значительно больше нейронов вокруг нано-архитектурных зондов на расстоянии от 100 до 150 микрон от места имплантации по сравнению с плавными имплантатами управления на четырехнедельной постимплантации. Нано-архитектуры были также FIB выгравированы вдоль задней стороны функционального одного хвостовика кремниевых микроэлектродов и электрофизиологических измерений были количественно исследовать, как травление нано-архитектуры влияет на производительность электрода. Электрофизиологические результаты показали увеличение процентов каналов, записывающих одиночные блоки из микроэлектротекродов нано-архитектуры, по сравнению с гладкими микроэлектродами управления.
Статистический анализ микроэлектротеки не проводился, поскольку только один из них был имплантирован для доказательства экспериментального исследования концепции. Офорт FIB позволяет исследователям исследовать, как добавление топографических сигналов на медицинских устройствах может улучшить реакцию клеток и, в конечном счете, производительность устройства. Ширина медицинских приборов, к которые могут быть применены эти методы, безгранична, так как FIB может быть выполнен на различных материалах, поверхностных геометриях и, самое главное, уже изготовленных устройствах.
