Este novedoso protocolo de trasplante de médula ósea se puede utilizar para investigar cómo las células dendríticas del huésped regulan las respuestas de injerto contra huésped e injerto contra leucemia después del trasplante. Las regeneraciones celulares ex vivo permiten adaptar este protocolo para probar el papel de otras poblaciones de células inmunitarias como los macrófagos y los neutrófilos simplemente modificando la condición de cultivo. Demostrando el procedimiento conmigo será el gerente de laboratorio Krystal Hossack y el estudiante Sanjeev Gurshaney.
Para la preparación de médula ósea C57BL/6 agotada por células T del donante, cosecha el fémur y la tibia de acuerdo con los protocolos estándar de ratones donantes eutanizados y transfiere los huesos a una placa Petri de 92 milímetros de diámetro que contenga un medio de 1%RPMI. Con tijeras, retire los extremos de cada hueso y llene una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 26 con un medio fresco de 1%RPMI. Inserte la aguja en un extremo de un hueso y presione el émbolo para eliminar la médula ósea de la cavidad y en un colador de células de recolección.
Una vez que se haya recogido toda la médula ósea, tensa las piezas de la médula ósea a través de un filtro de malla de 75 micrómetros y transfiere la suspensión de una sola célula a un nuevo tubo de 50 mililitros. Sedimentar las células por centrifugación y resuspender el pellet en un 20 veces 10 a las seis células por mililitro concentración en PBS complementado con 0.5%BSA. A continuación, agregue 0,05 microgramos de anticuerpos THI1 por uno por 10 a las seis células para una incubación de 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, lavar las células dos veces con 10 mililitros de PBS helado y resuspender el pellet a dos veces 10 a las siete células por concentración de mililitro en 0.5%BSA complementado con 10% de suplemento de conejo joven y 2%DNAse en agua estéril para una incubación de 45 minutos a 37 grados Celsius. Al final de la incubación, lave las células dos veces con 15 mililitros de PBS fresco por lavado y resusppend el pellet en 20 mililitros de PBS que contienen 0.5%BSA. Agrupa los ganglios linfáticos y el bazo en un colador de poro de 40 micrómetros y usa un émbolo de jeringa para macerar los tejidos a través de los filtros para liberar las células.
Lavar el colador y el émbolo con el medio RPMI complementado con 1%FBS para recoger todas las células y sedimentar las células por centrifugación. Agregue cinco mililitros de tónime de ACK al pellet de la célula. Después de cinco minutos a temperatura ambiente, detener la reacción con cinco mililitros de medio complementados con 1%FBS y peletizar los glóbulos blancos por centrifugación.
Resuspender el pellet en cinco mililitros de tampón MACS para contar y diluir las células a una concentración de dos veces 10 a las ocho células por mililitro en el búfer MACS fresco. Agregue la concentración adecuada de anticuerpos anti-eritroide, antigranulocitos, anti-células B y anti-células NK por uno por uno 10 a las seis células para una incubación de 15 minutos a cuatro grados celsius. Al final de la incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón MACS helado y resusppend el pellet en un solo 10 a las ocho células por concentración de mililitro en tampón MACS fresco.
A continuación, agregue 0,22 microlitros de microperlas antibiotinas por una vez 10 a las seis células con mezcla para una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón MACS frío y recoja las células T enriquecidas sin enlazar mediante separación magnética de cordón utilizando el separador MACSxpress de acuerdo con los protocolos de aislamiento de cuentas estándar. Al final de la separación, sedimentar las células T por centrifugación y resuspend el pellet en cinco mililitros de tampón MACS fresco para el recuento.
Para generar células dendríticas derivadas de la médula ósea, aísle la médula ósea de los fémures de tipo salvaje o de los ratones noqueadores del factor B como se ha demostrado y anule los glóbulos rojos en cinco mililitros de tampón de lisis ACK, deteniendo la reacción con 10 mililitros de RPMI complementados con 1%FBS después de cinco minutos. Después de recoger las células sanguíneas enteras por centrifugación, resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo a dos veces 10 a la sexta célula por mililitro de concentración y añadir 20 nanogramos por mililitro de GM-CSF a las células antes de sembrar 10 mililitros de células en platos individuales de 100 por 15 milímetros De Petri a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante seis días. En el sexto día, active los cultivos de células dendríticas derivadas de la médula ósea con 25 microgramos por mililitro de LPS por placa.
Al menos el 85% de las células de médula ósea cultivadas se diferencian en células dendríticas. La pureza de la célula T después del enriquecimiento magnético del cordón es del 90%El principal modelo C57BL/6 BALB/c no coincidente con MHC corresponde estrechamente al desarrollo de la EICH después del trasplante. El pico de gravedad ocurre aproximadamente 11 días después de la transferencia celular seguido de una reducción en las puntuaciones clínicas y la recuperación del peso corporal hasta el día 16.
Los receptores sucumbieron uniformemente a la EICH por 30 a 40 días después de la trasplante. Curiosamente, el trasplante con células dendríticas noqueadoras del factor B mejora la supervivencia de los receptores y las puntuaciones clínicas de la EICH. El linfoma de células B A20 transducido por Luciferase permite el monitoreo del crecimiento tumoral en animales vivos.
En este experimento representativo, todos los receptores BALB/c de tipo salvaje que recibieron médula ósea solos más A20 murieron de una recaída tumoral. Los receptores BALB/c de tipo salvaje trasplantados con células T de donantes con ACC1 de origen boneo agotadas por ACC1 murieron de EICH. Además, los animales que recibieron médula ósea del donante y células T agotadas por ACC1 murieron de la EICH y la recaída tumoral.
Para generar suficiente célula de médula ósea, la tibia y los huesos del fémur recogidos deben estar completamente libres de tejido muscular antes de la corrección de la médula ósea. La purificación negativa de las células de la médula ósea con micro-CD3 y anti-biotina MicroBeads también puede ser realizada para agotar el linfocitos de la médula ósea.
