El aislamiento en el análisis fenotípico de las células inmunitarias del intestino utilizando este protocolo ha demostrado ser aplicable a la comprensión de los trastornos inflamatorios sistémicos y gastrointestinales. Este método aísla un número significativo de células mononucleares viables al minimizar los desechos contaminantes permitiendo el posterior fenotipado inmune por la Atomistry de Fleur u otros métodos. Como el intestino es un sitio objetivo principal de inflamación en muchas enfermedades, este protocolo puede ser útil para el estudio de poblaciones inmunes intestinales en modelos de ratón de cáncer, alergia, trasplante y autoinmunidad.
Para optimizar el rendimiento y la eficiencia de este protocolo, se recomienda que las soluciones y materiales clave se preparen con antelación como se ha señalado. Después de eutanasiar el ratón y hacer una incisión vertical de línea media, utilice tijeras de disección fina para abrir el peritoneo. Usando fórceps, mueva el intestino delgado a un lado y exponga el colon descendente.
Tire hacia arriba ligeramente sobre el colon descendente para exponer al máximo la porción rectal del colon. Luego, corta el recto distal en lo profundo de la pelvis y disecciona todo el colon como una unidad desde el recto distal hasta la tapa del cecal. Primero, coloca el colon sobre una toalla de papel humedecida y usa el extremo romo de un par de tijeras o fórceps para aplicar una presión leve en la pared intestinal y extraer las heces sólidas.
A continuación, coloque el colon en una placa de petri y use una jeringa de 10 mililitros con una aguja llena de contundentes de calibre 18 para lavar el intestino con 10 mililitros de tampón de colon refrigerado. Coloque el colon en un plato de petri lleno de 5-10 mililitros de tampón de colon refrigerado y agitar manualmente para lavar el contenido de colon restante. Repita este lavado de 2 a 3 veces, utilizando una nueva placa de petri que contenga tampón fresco para cada lavado.
Después de esto, transfiera el colon a una nueva placa de petri que contenga tampón de colon frío fresco. Corte el colon longitudinalmente desde su extremo rectal más musculoso hasta el colon proximal, para generar una sola pieza rectangular de colon abierta. Deseche la mediana en el plato y reemplácela con un tampón de colon frío limpio.
Coloque el tejido rectangular del colon sobre una toalla de papel que esté humedecida con tampón de colon y córtelo cortando horizontalmente y luego en pequeños fragmentos. Utilice fórceps finos para recoger los fragmentos de colon en un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros que contiene 20 mililitros de tampón de colon refrigerado. A continuación, lave los fragmentos girando vigorosamente el tubo durante 30 segundos.
Después del lavado, deje que los fragmentos de tejido se asienten en la parte inferior del tubo antes de decantar o aspirar al vacío el sobrenadante, Asegurándose de evitar la pérdida de fragmentos de tejido, repita todo este proceso de lavado 3 veces usando tampón de colon fresco para cada lavado. Para comenzar, agregue 20 mililitros de tampón de digestión de colagenasa al tubo que contiene los fragmentos de colon lavados. Selle el tubo y colóquelo en un agitador orbital a 37 grados celsius con una velocidad de rotación de 2 veces G durante 60 minutos.
Asegúrese de que los fragmentos de tejido estén en constante movimiento durante la agitación. En primer lugar, vierta 5 mililitros de medios de separación de densidad basados en sílice al 66% en cada uno de 3 tubos de polipropileno separados de 15 mililitros. A continuación, utilice una pipeta serológica de 25 mililitros para recoger sólo el sobrenadante de la digestión de colagenasa 1.
Filtrar el sobrenadante a través de un colador de células de tejido de filtración deficiente de 40 microlitros colocado en un tubo cónico de polipropileno limpio de 50 mililitros. Llene el tubo completamente con tampón de colon frío para apagar el tampón de digestión de colagenasa. Luego gira las células, aspira el sobrenadante, y mantén el pellet en hielo.
Continúe realizando la digestión de la colagenasa 2 como se describe en el protocolo de texto. Una vez completada la digestión de la colagenasa 2, enjuague los fragmentos de tejido vigorosamente hacia adelante y hacia atrás entre el tubo y una jeringa de 10 mililitros a través de una aguja de extremo romo de calibre 18. Repita este rubor durante al menos 7-8 pasajes, continuando hasta que no se visiblen fragmentos de tejido bruto o debri.
A continuación, pase la suspensión de desagregación de tejido a través de un colador celular de tejido de filtración deficiente de 40 micrómetros colocado en un tubo de polipropileno limpio de 50 mililitros. Llene el tubo hasta el borde con tampón de colon frío para saciar la digestión y centrifugar a 800 veces G en 4 grados Celsius durante 5 minutos. Deseche el sobrenadante a través de la aspiración al vacío y tire del pellet re suspendido de la digestión de la colagenasa 1 a su tubo correspondiente.
Después de esto, vuelva a suspender cada pellet en 24 mililitros de medios de separación de densidad basados en 44%sílice por colon. Utilice una pipeta serológica de 10 mililitros para colocar lentamente 8 mililitros de este medio en cada uno de los 3 tubos que contienen 66%medios de separación de densidad basados en sílice. Equilibre cuidadosamente los tubos dentro de los cubos centrífugos con una báscula de pesaje o una balanza.
Centrifugar a 859 veces G en 20 grados Celsius durante 20 minutos sin el descanso. Deje que las varillas vengan a descansar antes de retirar los tubos, teniendo cuidado de no interrumpir las células en la interfaz de gradiente. En primer lugar, visualice la interfaz de gradiente cerca de la marca de 5 mililitros, donde normalmente está presente una banda blanca de 1-2 mililitros de espesor.
Aspirar al vacío y desechar los 7 mililitros superiores del gradiente para facilitar el acceso de la pipeta a la interfaz. Usando la succión manual continua y el movimiento constante de la muñeca giratoria, recoja la capa de interfaz de las células. Recoger hasta que la interfaz entre los dos gradientes sea clara y refractista y transferir la interfaz a un nuevo tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros.
A continuación, agregue FACS Buffer a esta bañera hasta que la suspensión total alcance los 50 mililitros. Centrifugar a 800 veces G en 4 grados Celsius durante 5 minutos. A continuación, aspirar el sobrenadante a través de la aspiración al vacío y suspender el pellet en 1 mililitro de FACS Buffer.
El procedimiento descrito en este video se puede utilizar para aislar células mononucleares del colon o, con modificaciones, del intestino delgado. Además, se realiza citometría y análisis de datos para comparar las fracciones de linfocitos apoptóticos y necróticos/muertos cuando se utiliza la Collagenasa E o D para el aislamiento, con nuestro sin tratamiento DNAse 1. Después de la suposición 5 y la tinción fijable de colorante azul muerto vivo en suspensiones de una sola célula después de cada aislamiento, la collagenasa E sin DNAse mostró un porcentaje significativamente mayor de células vivas después del aislamiento en comparación con la colagenasa D sin DNAse.
Incluso en comparación con cualquiera de las colagenasas con DNAse. Además, identificamos células necróticas en un porcentaje medio del 41,0% en el grupo Collagenase E frente al 90,0% en el grupo Collagenase D. 75,9% en el grupo Collagenase E DNAse y 80,3% en el grupo Collagenase D DNAse.
A continuación, la citometría de flujo perimétrico múltiple se aplica a MNC aislado de ratones receptores de válvula CD45.2 C el día 7 después de recibir BMT o modelos BMT alogénicos o singéneos. Se calculan y comparan los números absolutos medios de células T positivas CD4 del donante y CD8 positivas extraídas del colon del receptor BMT. Por lo tanto, puede ser importante identificar y/o cuantificar poblaciones raras de células inmunitarias en estos modelos de ratón.
Los subconjuntos raros, incluidas las células reguladoras T positivas FOX-P3 derivadas del donante, se evalúan en modelos BMT singéneos y alogénicos. Usando este método, incluso se pueden analizar subconjuntos raros, como el regulador del T del colon derivado del donante que se infiltra en el colon del ratón receptor, después de BMT. Cabe señalar que la collagenasa E está activa a 37 grados centígrados.
Por lo tanto, todas las soluciones de colagenasa deben ser precaleadas para una actividad adecuada de la colagenasa y completamente apretadas para terminar la actividad. Este protocolo permite un gran número de células mononucleares que se pueden utilizar para la posterior caracterización por una citometría Fleur, técnicas de biología molecular, microscopía, cultivo, y sitio de, entre otros. Este protocolo proporcionó una evaluación confiable de la inflamación en el colon de ratones experimentales frente a ratones controlados en un modelo de trasplante de médula ósea.
Facilitando así el descubrimiento de nuevos mecanismos inmunológicos reglamentarios de tolerancia a trasplantes. La colagenasa de Clostridium Istoliticum es un reactivo que debe manipularse con técnicas de seguridad de laboratorio. Supone un riesgo para la salud cuando se inhala y puede causar irritación de la piel y los ojos.
