Estamos en deuda con Alice Wang Jiao Gaughan y Jing-cuyo excelente soporte técnico, aportación intelectual, y el apoyo moral jugaron un papel decisivo en el movimiento de estos estudios por delante. Estos estudios fueron apoyados por el NIH AI036532 subvención a GAH.

1. Irradiación letal <ol><li> Coloque hasta 10 ratones receptores en una jaula microisolator compatible con el irradiador para ser utilizado. </li><li> Irradiar en 2 dosis iguales de suma dosis total (dosis total = 9 cGy para los receptores BALB.B). En segundo lugar irradiación debe ser de 3 horas después de la primera. La inyección debe tener lugar entre 4-6 horas después de la irradiación final. Irradiar ratones, ya sea en origen o Cs 137 RS2, 000 irradiador,. </li><li> Después de la segunda dosis de radiación, ratones tiendas en microisolator jaula con agua acidulada hasta el momento del trasplante. </li></ol> 2. Preparación de esplenocitos <ol><li> Eutanasia a un ratón donante de acuerdo con las directrices institucionales. Cada donante generalmente produce 75x10 6 - 125x10 6 esplenocitos. Uso de kits de purificación de CD8, cada ratón generalmente produce 6x10 6 - 12x10 6 células T CD8. </li><li> Extirpar el bazo haciendo primero una incisión verticales 2 cm 2 cm a la derecha de la línea media directamentedebajo de las costillas. Cortar a través de la piel, la piel y membrana visceral. </li><li> Eliminar el bazo y crear suspensión de células individuales mediante la colocación de bazo en 40 tamiz de malla l en una placa de Petri con medio RPMI 1640 con FBS al 5%. Utilice un émbolo de la jeringa para romper el bazo hasta el bazo entero ha sido pasado a través de tamiz de malla. </li><li> Repita este proceso para cada donante WT y L2G85.B6. Recoge todas las suspensiones de células individuales en WT 1-50 ml tubo cónico, y recoger todas las L2G85.B6 suspensiones de células individuales en un tubo cónico separado 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 1.200 rpm durante 10 min a 4 ° C. Volver a suspender las pastillas en 1640 RPMI con FBS al 5% y las células de recuento. </li></ol> 3. Bone Marrow Preparación <ol><li> Quitar la piel de una extremidad posterior de un ratón donante. </li><li> Corte con cuidado el tejido muscular como sea posible a partir de fémur y de la tibia / peroné. </li><li> Quite la extremidad posterior cortando fémur nivel de la articulación coxofemoral. Cortar la pata trasera justo debajo de tibia / peroné intersección. Todos los cortes óseos debe hacerse con unas tijeras resistentes. </li><li> Retire con cuidado el tejido muscular restante. Corte el peroné-relativamente poco médula ósea se encuentra en el peroné y no vale la pena el esfuerzo. </li><li> Coloque la extremidad posterior en frío RPMI 1640 al 5% de SFB y repita el proceso con la segunda pata trasera. Cada ratón debe producir entre 6 20x10 - 40x10 6 células de la médula ósea. </li></ol> 4. Bone Marrow eliminación <ol><li> Retire una extremidad posterior de los medios de comunicación y el lugar en gran placa de Petri con una pequeña cantidad de medio frío (~ 1 ml). </li><li> Corte la articulación de la rodilla. Usando una jeringa (volumen&gt; 5 ml), la aguja de inserción subcutánea en la tibia y deprimir jeringa hasta que todo el material de color rojo se retira del interior de la tibia. Repita el proceso con el fémur. Descartar huesos restantes desprovistos de médula ósea. Repita el proceso con las extremidades posteriores segundo. </li><li> Crear suspensión de células individuales por medios de comunicación de pipeteado que contienen médula ósea en gran placa de Petri y el émbolo de jeringa y uso l 40malla. Pipetear única suspensión de células en 50 ml de tubo cónico y se mantiene en hielo. </li></ol> 5. CD3 agotamiento Hay una variedad de maneras para agotar las células CD3 + de la médula ósea. Nuestro laboratorio utiliza un kit compuesto por Miltenyi Biotec (CD3-biotina - 130-093-021). Agotan las células CD3 + de la médula ósea después de protocolo del fabricante. El tampón de Miltenyi para los kits de ahora en adelante se llamará MACS Buffer (2 mM EDTA, 0,5% de BSA en PBS, pH 7,2). <ol><li> Lavar las células por centrifugación de esplenocitos y células de la médula ósea a 1200 rpm durante 10 min a 4 ° C, las células y el recuento. </li><li> Quite todo el sobrenadante. Volver a suspender las células de médula ósea en 100 l por 10 millones de células de médula ósea en el tampón de MACS. </li><li> Continuar con CD3 agotamiento fabrica utilizando protocolo. </li><li> Lavar CD3 depleción de células de médula ósea 3 veces en PBS estéril. Conde CD3 agotado las células de la médula ósea y se resuspende en un volumen apropiado para inyectar 10 7 células. </li></ol> Hay una variedad de maneras de purificar las células T CD8 de L2G85.B6 ratones. Además, hay varias maneras para agotar las células T CD8 de donantes WT esplenocitos. Nuestro laboratorio utiliza kits de Miltenyi Biotec (CD8 agotamiento - 130-049-401, CD8 purificación - 130-095-236). <ol><li> Resuspender el pellet en 90 PESO Buffer MACS l por 10 7 células. Continuar con la depleción de células T CD8 de acuerdo a las manufacturas &quot;protocolo (CD8 agotamiento - 130-049-401). </li><li> Resuspender el pellet en 40 L2G85.B6 Buffer MACS l por 10 7 células. Continuar con la purificación de células T CD8 de acuerdo a las manufacturas &quot;protocolo (CD8 purificación - 130-095-236). </li><li> Contar cada población celular y lavar cada población 3 veces con PBS estéril. Resuspender cada población en volumen apropiado inyectar 18x10 6 WT (CD8 empobrecido) esplenocitos y 2x10 6 L2G85.B6 purificó células T CD8. </li></ol>7. Inyección Preparación <ol><li> Combinar 10 7 CD3 agotadas las células de médula ósea, 18x10 6 esplenocitos WT (CD8 empobrecido) y 2x10 L2G85.B6 6 purificadas las células T CD8 en un tubo de microcentrífuga. Lavar con PBS estéril y se resuspende en 300 l. </li><li> Inyectar la preparación de células en la vena de la cola de ratones receptores. Las inyecciones se debe realizar con agujas de calibre 28. </li><li> Tienda de ratones en jaulas microisolator con agua acidulada. Calificación de ratones diariamente con sistema de puntuación de puntuación desarrollado GVHD por Cooke et al 1. </li></ol> 8. Bioluminiscente de imágenes <ol><li> Seis días después del trasplante, se inyectan ratones receptores con 4 mg de D-luciferina. Permitir 5 min para luciferina para reaccionar con luciferasa. </li><li> Se anestesia el ratón en la cámara de isoflurano imager bioluminiscencia y receptores de imagen de 5 min con binning pequeño. Esto creará una imagen de alta resolución mientras se obtienen tantos eventos como sea posible. </li><li> Analizar datos usando LivingImagen de software. La escala de la imagen de pseudo-color se puede cambiar para obtener los mejores resultados. Sin embargo, es imperativo que la misma escala que se utiliza a través de experimentos. </li><li> Las regiones de interés pueden ser creados usando software Living imagen y la emitancia luz puede ser cuantificado mediante el cálculo del flujo (fotones / seg) que se emite desde cada región de interés. </li></ol> 9. Los resultados representativos Aproximadamente 7-10 días después del trasplante, los ratones comienzan a mostrar signos clínicos de la GVHD. Los ratones parecen desaliñados debido a la falta de preparación. Los receptores también comenzará a perder peso entre 7-10 días después del trasplante. La actividad y la postura de los ratones receptores se mantendrá relativamente normal hasta aproximadamente el día después del trasplante 12-14. Acumulativos puntuaciones de GVHD aumentará constantemente a través de la primera 2-3 semanas después del trasplante (Figura 1A). Curso de la enfermedad es muy variable entre los ratones, sin embargo, los beneficiarios de manera uniforme debe sucumbir a la GVHD por 30-40 days después del trasplante (Figura 1B). La Figura 2 muestra que los ratones receptores fueron fotografiadas 6 días después del trasplante. Pseudo-coloreado escala muestra diversos emitancia luz por todo el cuerpo con la mayor intensidad de la luz que se emite en el bazo y el intestino. Acumulación de células T CD8 en el intestino es coherente con resultados anteriores 6. Los ratones receptores se pueden colocar de nuevo en la jaula de microisolator a ser reflejado en un punto temporal posterior o a eutanasia por ex vivo de imágenes. <table border="1"><tbody><tr><td> Criterios </td><td> Grado 0 </td><td> Grado 1 </td><td> Grado 2 </td></tr><tr><td> Pérdida de peso (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Postura </td><td> Normal </td><td> Encorvando sólo en reposo </td><td> Varios encorvado; perjudica movemeNuevo Testamento </td></tr><tr><td> Actividad </td><td> Normal </td><td> Leve a moderada disminución en la actividad </td><td> Estacionaria menos que se estimule </td></tr><tr><td> Fur textura </td><td> Normal </td><td> Leve a moderado revolviendo </td><td> Fruncido grave / mala preparación </td></tr><tr><td> Textura de la piel </td><td> Normal </td><td> El escalado de las patas traseras / </td><td> Áreas obvias de piel desnuda </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Cooke et al desarrollaron este sistema de puntuación en 1996 1. Los ratones se anotó diariamente en cada uno de los criterios de la izquierda. Cada ratón se le da una puntuación de 0-2 para cada criterio y la puntuación total es la suma de todas las puntuaciones individuales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Figura 1. Letalmente BALB.B irradiados fueron trasplantados con 10 7 óseacélulas de la médula solos o con 18x10 6 agotada de células T CD8 esplenocitos WT y 6 2x10 purificados L2G85.B6 células T CD8. A) los datos de puntuación clínica de los receptores de médula ósea solo o con CD8 agotada de células T WT esplenocitos y se purificó L2G85.B6 células T CD8. B) Los datos de supervivencia de los receptores de médula ósea sola o con células T CD8 agotado esplenocitos WT y purificado L2G85.B6 células T CD8. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Figura 2. BALB.B ratones letalmente irradiados fueron trasplantados con 10 7 células de la médula ósea solo o con 18x10 6 agotada de células T CD8 esplenocitos WT y 6 2x10 purificados L2G85.B6 células T CD8. Los receptores fueron inyectados con 4 mg de D-luciferina mediante inyección intraperitoneal y se obtuvieron imágenes utilizando Xenogen IVIS durante 5 min a binning pequeño. Saleudo de color imágenes se muestran en púrpura representa la intensidad baja y el rojo representa las regiones de alta intensidad de interés se extrajeron alrededor de todo el ratón y el flujo total (fotones / s) fueron cuantificados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Figura 3. BALB.B ratones letalmente irradiados fueron trasplantados con 10 7 células de la médula ósea solo o con 18x10 6 agotada de células T CD8 esplenocitos WT y 6 2x10 purificados L2G85.B6 células T CD8. Los receptores fueron inyectados con 4 mg de D-luciferina mediante inyección intraperitoneal y se obtuvieron imágenes utilizando Xenogen IVIS durante 5 min a binning pequeño. Pseudo-color imágenes se muestran en púrpura representa la intensidad baja y el rojo representa la intensidad alta. Los beneficiarios fueron imágenes en un día) 4, B) el día 6, y C) el día 8 después de la transferencia.

<ol>
	<li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation:+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin.">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li><li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens.">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li><li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+CD8++cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial.">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li><li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences.">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li><li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment,+rejection,+and+survival+in+transplantation.">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li><li>Asady, R. E. l. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-{beta}-dependent+CD103+expression+by+CD8(+)+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease.">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li><li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+leukocyte+integrins.">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li><li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+(alpha+E+beta+7).">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li><li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin.">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li><li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen,+H60.">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El protocolo para la inducción de la GVHD en ratones presentados aquí representa un modelo clínicamente relevante de GVHD murino. Originalmente establecida por Berger et al., En 1994, la C57Bl / 6 en combinación cepa BALB.B es MHC-emparejado, con una mortalidad GVHD mediada por CD4, CD8 efectoras dependientes de T 2, muy similares a las del escenario clínico más común 3. Se sabe que el trasplante de las células T CD8 solo no causa GVHD en este modelo, sin embargo, la progresión de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternero fetal </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 mM filtro de células </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-Biotina </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-biotina microperlas </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a microperlas </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Se utiliza para agotar las células T CD8 de bazo. </td></tr><tr><td> Purificación de anticuerpos CD8a Cocktail </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Se utiliza para purificarCélulas T CD8 de bazo. </td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induction of graft-versus-host disease and in vivo t cell monitoring using an mhc-matched murine model

Enfermedad de injerto contra huésped (EICH) es la barrera limitante para el uso amplio de trasplante de médula ósea como terapia curativa para una variedad de deficiencias hematológicas. GVHD es causada por las células T maduras alorreactivas presentes en el injerto de médula ósea que se infunden en el receptor y causar daños en los órganos receptores. Sin embargo, en ratones, las células T se debe añadir al inóculo de médula ósea a causan la GVHD. Aunque extenso trabajo que se ha hecho para caracterizar células T después del trasplante, respuestas, bioluminiscente tecnología de imagen es un método no invasivo para monitorizar los patrones de tráfico de células T in vivo. Después de la irradiación letal, los ratones receptores se trasplantan con células de médula ósea y esplenocitos de ratones donantes. Subconjuntos de células T de L2G85.B6 (ratones transgénicos que expresan constitutivamente luciferasa) se incluyen en el trasplante. Por sólo trasplantar ciertos subconjuntos de células T, uno es capaz de rastrear específicos subconjuntos de células T in vivo,y en base a su ubicación, el desarrollo de hipótesis con respecto a la función de subconjuntos de células T específicas en la promoción de la GVHD en diversos puntos temporales. En trasplante predeterminado después de intervalos, los ratones receptores son imágenes utilizando una cámara CCD Xenogen IVIS. La intensidad de luz puede ser cuantificado usando software Living imagen para generar una imagen de pseudo-color en función de la intensidad de fotones (rojo = alta intensidad, violeta intensidad = bajo). Entre 4-7 días después del trasplante, los ratones receptores comienzan a mostrar signos clínicos de la GVHD. Cooke et al. 1 desarrolló un sistema de puntuación para cuantificar la progresión de la enfermedad en función de la textura de la piel destinatario ratones, integridad de la piel, la actividad, pérdida de peso y la postura. Los ratones se obtuvo diariamente, y sacrificados cuando se convierten moribundo. Los ratones receptores se convierten generalmente en moribundo 20-30 días después del trasplante. Los modelos murinos son herramientas valiosas para el estudio de la inmunología de la GVHD. Selectivamente trasplante particular, subconjuntos de células T almínimos para la identificación cuidadosa de las funciones que cada subconjunto juega. No invasiva seguimiento de las respuestas de células T in vivo agrega otra capa de valor para los modelos murinos GVHD.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model at JoVE.com

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células T<em&gt; In vivo</em&gt; Permite el análisis detallado del desarrollo y perpetuación de la respuesta de células T durante la enfermedad de injerto contra huésped.

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

induction-graft-versus-host-disease-vivo-t-cell-monitoring-using-an

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

15.6K vistas.  The Ohio State University Medical Center. Trasplante de médula ósea murina es una técnica ampliamente utilizada para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan injerto contra huésped enfermedad en los seres humanos. La capacidad para monitorear los patrones de tráfico de células T In vivo Permite el análisis detallado del desarrollo y perpetuación de la respuesta de células T durante la enfermedad de injerto contra huésped.

Video: Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro mediante Espectroscopia de Impedancia: Un enfoque en la interacción de células T de la célula endotelial

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

En Vivo Ensayo para la detección de la función citolítica de células T específicas de antígeno utilizando un modelo de vacunación

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modelo de cultivo primario de células Bursal de pollo Ex Vivo para estudiar la patogenesia de la enfermedad Bursal infecciosa Virus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, thymic derived Treg (tTreg) cells and peripherally induced Treg (pTreg) cells. They are present in different organs of our body and can be distinguished by specific markers, such as Helios and Neuropilin 1. It has been reported that tTreg cells are functionally more suppressive than pTreg cells. Therefore, it is important to determine the proportion of both tTreg and pTreg cells when investigating heterogeneous cell populations. Herein, we collected thymic glands, pancreatic draining lymph nodes and spleens from normoglycemic non-obese diabetic mice to distinguish tTreg cells from pTreg cells using flow cytometry. We manually prepared single cell suspensions from these organs. Fluorochrome conjugated surface CD4, CD8, CD25, and Neuropilin 1 antibodies were used to stain the cells. They were kept in the fridge overnight. On the next day, the cells were stained with fluorochrome conjugated intracellular Foxp3 and Helios antibodies. These markers were used to characterize the two subsets of Treg cells. This protocol demonstrates a simple but practical way to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen and use them for subsequent flow cytometric analysis.

Herein, we present a protocol to prepare single cells from murine thymus, pancreatic draining lymph node and spleen to further study these cells using flow cytometry. In addition, this protocol was used for determining the subsets of regulatory T cells using flow cytometry.

Determinación de subconjuntos de células T reguladoras en murino timo, pancreático drenaje del nodo de linfa y bazo mediante citometría de flujo

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...