Los elementos reguladores de cis como los promotores y potenciadores son determinantes clave de la expresión génica. Los enfoques tradicionales para estudiar estos elementos son laboriosos y a menudo implican el uso de genes reporteros heterólogos. Aquí demostramos el uso de CRISPR para examinar el papel transcripcional de un silenciador intrínso RUNX1 en la línea celular de la leucemia.
El protocolo es fácil de realizar y permite realizar evaluaciones rápidas de las funciones reguladoras genéticas en el contexto genético endógeno. Las células hematopoyéticas a menudo son difíciles de transfeccionar con métodos basados en plásmido. En este protocolo, utilizamos la electroporación para entregar Cas9 premontado, ARN guía, complejos en las células.
Las ventajas de este enfoque incluyen el uso de una mayor eficiencia de edición y viabilidad celular, así como una reducción de los efectos fuera de destino. Además, el uso posterior del análisis de fragmentos permite la detección simple y rápida de los clones mutantes deseados a partir de una gran cantidad de muestras. Demostrando el procedimiento estará Yuk-Lin Yung, técnico de mi laboratorio.
Comience diseñando dos ARN CRISPR, uno cinco primo y los otros tres primos del elemento regulador de cis objetivo, o CRE. Asegúrese de que un PAM de NGG esté situado inmediatamente aguas abajo de la secuencia de destino para el reconocimiento Cas9. Para formar el complejo de ARN, combine el ARN CRISPR y el ARN trazador en el búfer TE según las indicaciones del manuscrito, para una concentración dúplex final de 44 micromolares.
Incubar la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos y dejar que se enfríe a temperatura ambiente. Diluir la nucleasa Cas9 recombinante con PBS para una concentración final de nucleasa de 36 micromolares. A continuación, mezcle un volumen igual de la nucleasa diluida con cada uno de los dúplex de GRNA e incubarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación del complejo RNP.
Centrifugar 2,5 millones de células en un tubo de 1,5 mililitros a 500 g durante cinco minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 163 microlitros de RPMI 1640 medio sin rojo fenol. Añadir 16,7 microlitros del complejo RNP y 3,6 microlitros de 100 potenciadores de electroporación micromolar a las células y transferir la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 centímetros de separación, teniendo cuidado de no introducir ninguna burbuja.
Electroporar las células y transferirlas a un matraz de cultivo de tejido T-25 que contenga 6 mililitros de rpm 1640 medio completo. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Un día después de la electroporación, diluir las células a 5000 células por mililitro en un medio completo RPMI 1640.
Y agregue 100 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Cultivar las células durante siete a 14 días y luego extraer ADN genómico utilizando un sistema de purificación de alto rendimiento. Agregue 100 microlitros de unión de placas y búfer de lysis a cada pozo de una placa de extracción de 96 pozos, seguido de 50.000 células re-suspendidas en 10 microlitros de PBS.
Mezclar el contenido del pozo en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que el ADN genómico se una a los pozos. A continuación, aspirar cuidadosamente la solución de los pozos y lavarlos con 120 microlitros de tampón de lavado.
Seque al aire la placa. Añadir 20 microlitros de mezcla de PCR a cada pozo y ejecutar PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Una vez completada la amplificación, estime la cantidad del producto midiendo la concentración de un número seleccionado de muestras con un fluorómetro.
Diluir todas las muestras a 0,5 nanogramos por microlitro con agua libre de nucleasas. Mezclar un microlitro del producto PCR diluido con 8,5 microlitros de forma desionizadamida y 0,5 microlitros de tamaño con etiqueta de colorante fluorescente estándar en un plat de 96 pozos compatible con el analizador genético. Cubra la placa con un septo de placa y desnaturalizar las muestras a 95 grados Celsius durante tres minutos en un termociclador.
Realizar electroforesis capilar para separar los productos de PCR etiquetados y analizar los resultados en el software de análisis. Compruebe el icono naranja para ver los fragmentos etiquetados y el estándar de tamaño para evaluar la calidad de las llamadas de tamaño. A continuación, compruebe el icono azul para ver los productos PCR etiquetados.
Identifique los picos correspondientes a los productos de tipo salvaje y mutantes y estime el nivel mutante en cada muestra dividiendo el área bajo el pico mutante por la suma del área bajo los picos de tipo salvaje y mutante. Seleccione varias agrupaciones de celdas con altos niveles de las eliminaciones esperadas para otras diluciones en serie. Repita los pasos de extracción de ADN, PCR fluorescente y electroforesis capilar y seleccione clones con niveles mutantes superiores al 95% para su posterior análisis.
Extraiga el ARN total de los clones seleccionados y realice la síntesis de ADN de forma gratuita. Mezclar el ARN con una imprimación poli-T y dNTP de acuerdo con las instrucciones del manuscrito e incubar a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, coloque la reacción sobre hielo durante al menos un minuto.
Añadir diez microlitros de mezcla de síntesis de ADNn a la reacción. Luego incubar la muestra a 50 grados Celsius durante 50 minutos y 85 grados Celsius durante cinco minutos en un termociclador. Después de la síntesis de ADNr, tratar las muestras con un microlitro de RNase H e incubarlas a 37 grados Celsius durante 20 minutos.
Diseñar imprimaciones y sondas TaqMan específicamente para la varianza de transcripción individual generada a partir de promotores alternativos y clonar los fragmentos de ADN que contienen las secuencias de transcripción específicas en ADN plásmido. Haga una serie de dilución de diez veces de los plásmidos recombinantes como curvas estándar para la cuantificación de transcripciones. Prepare 20 microlitros de mezcla de PCR para cada muestra y ejecute el PCR en tiempo real de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Analice los resultados y normalice el número de copia de las transcripciones de destino en cada muestra con un gen de limpieza. Este protocolo se ha utilizado con éxito para eliminar el silenciador intrínsal RUNX1 y la eliminación se confirmó con electroforesis de gel capilar. Los tamaños esperados de los productos de PCR mutante y de tipo salvaje son aproximadamente 500 pares base y 230 pares base respectivamente.
El tamaño de los productos mutantes puede variar entre los clones debido a los indels formados en los sitios de escote. La secuenciación de Sanger se utilizó para confirmar la identidad de las eliminaciones. El gen RUNX1 contiene dos promotores, P1 y P2 que produjeron tres transcripciones principales de ARNm: RUNX1c por P1, y RUNX1a y RUNX1b por P2. Se puede utilizar la PCR cuantitativa en tiempo real para determinar cómo afecta la eliminación del elemento silenciador a la expresión de estas transcripciones.
Un buen diseño de ARN CRISPR es importante para su evaluación del experimento. Asegúrese de que el ARN CRSIPR esté empaquetado estrechamente en la región de eliminación prevista. Además, asegúrese de que una secuencia PAM se encuentra aguas abajo de la secuencia de destino para el reconocimiento Cas9.
Además de estudiar las RSE, esta estrategia se puede utilizar para estudios de localización de genes y sirve como una alternativa a la interferencia de ARN para examinar las funciones genéticas. Al combinar con técnicas de captura de conformación cromosómica, CRISPR sin duda ayudará a descifrar las implicaciones de las ERC en la organización alterada del genoma y la expresión génica vinculada a diversos problemas de salud como el cáncer.
