Organizatörler ve arttırıcılar gibi Cis-düzenleyici unsurlar gen ekspresyonunun temel belirleyicileridir. Bu unsurları incelemek için geleneksel yaklaşımlar zahmetli ve genellikle heterolog muhabir genlerin kullanımını içerir. Burada lösemi hücre hattında bir RUNX1 intronic susturucu transkripsiyonel rolünü incelemek için CRISPR kullanımını göstermektedir.
Protokolün gerçekleştirilen süreceği ve endojen gen kapsamında gen düşürülmelerinin hızla değerlendirileceğine olanak sağlıyor. Hematopoetik hücreler genellikle plazmid bazlı yöntemlerle transfect zordur. Bu protokolde, elektroporasyonu önceden monte edilmiş Cas9'u, kılavuz RNA'yı hücrelere karmaşıklık ları sağlamak için kullanıyoruz.
Bu yaklaşımın avantajları arasında gelişmiş düzenleme verimliliği ve hücre canlılığının yanı sıra hedef dışı etkilerin azaltılması yer almaktadır. Ayrıca, parça analizi nin sonraki kullanımı, istenilen mutant klonların çok miktarda numuneden basit ve hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Prosedürü gösteren Yuk-Lin Yung, laboratuvarımiçin teknisyen olacak.
İki CRISPR RNA, bir beş asal ve hedef cis-düzenleyici unsur veya CRE diğer üç asal tasarlayarak başlayın. Cas9 tanıma için hedef sıranın hemen aşağısında ngg pam'in bulunduğundan emin olun. gRNA kompleksini oluşturmak için, 44 mikromolar son dubleks konsantrasyonu için, el yazması yönlere göre TE tampon crispr RNA ve tracer RNA birleştirin.
Karışımı 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. 36 mikromolar son nükleaz konsantrasyonu için PBS ile rekombinant Cas9 nükleaz seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş çekirdeğin eşit hacmini gRNA dublekslerinin her biriyle karıştırın ve RNP kompleksinin oluşmasını sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Santrifüj 2.5 milyon hücre 1.5 mililitrelik bir tüp beş dakika için 500 kez g. Daha sonra supernatant atın ve fenol kırmızı olmadan RPMI 1640 orta 163 mikrolitre hücreleri yeniden askıya. RNP kompleksinin 16,7 mikrolitresini ve hücrelere 100 mikromolar elektroporasyon arttırıcısının 3,6 mikrolitresini ekleyin ve karışımı 0,2 santimetrelik bir elektroporasyon kütüğüne aktarın, herhangi bir kabarcık sokmamaya özen takın.
Hücreleri elektroporate ve tam RPMI 1640 orta 6 mililitre içeren bir T-25 doku kültürü şişesi ne aktarın. Hücreleri %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Elektroporasyondan bir gün sonra, hücreleri mililitre başına 5000 hücreye seyreltin tam RPMI 1640 orta.
Ve 96 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyunun içine 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Kültür hücreleri yedi ila 14 gün sonra yüksek iş lenme arıtma sistemi kullanarak genomik DNA ayıklamak. 96 kuyulu ekstraksiyon plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre plaka bağlama ve lisis tamponu ekleyin ve ardından 10 mikrolitre PBS'de 50.000 hücre yeniden askıya alınır.
Yukarı ve aşağı borulama tarafından kuyu içeriğini karıştırın. Genomik DNA'nın kuyulara bağlanmasıiçin tabağı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra kuyulardan çözeltiyi dikkatlice aspire edin ve 120 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın.
Hava plakayı kurutun. Her kuyuya 20 mikrolitre PCR karışımı ekleyin ve el yazması talimatlara göre PCR çalıştırın. Amplifikasyon tamamlandıktan sonra, seçilen sayıda numunenin bir florometre ile konsantrasyonunu ölçerek ürünün miktarını tahmin edin.
Tüm numuneleri mikrolitre başına 0,5 nanograma çekirdeksiz su ile seyreltin. Seyreltilmiş PCR ürününün bir mikrolitresini 8,5 mikrolitre deiyonize formamid ve 0,5 mikrolitre floresan boya etiketli boyut standardı ile genetik analizörle uyumlu 96 kuyuluk bir plat ile karıştırın. Plakayı bir tabak septa ile kaplayın ve numuneleri bir termocycler'da üç dakika boyunca 95 derecede denatüre edin.
Etiketli PCR ürünlerini ayırmak ve analiz yazılımındaki sonuçları analiz etmek için kılcal elektroforez gerçekleştirin. Etiketli parçaları ve boyut belirleme nin kalitesini değerlendirmek için boyut standardını görüntülemek için turuncu simgeyi işaretleyin. Ardından, etiketli PCR ürünlerini görüntülemek için mavi simgeyi işaretleyin.
Yabani tip ve mutant ürünlere karşılık gelen zirveleri belirleyin ve her örnekteki mutant seviyesini, mutant tepenin altındaki alanı vahşi tip ve mutant zirvelerin altındaki alanın toplamına bölerek tahmin edin. Daha fazla seri seyreltme için beklenen silme yüksek düzeyde birden fazla hücre havuzları seçin. DNA ekstraksiyonu, floresan PCR ve kapiller elektroforez adımlarını tekrarlayın ve sonraki analizler için mutant seviyeleri %95'ten fazla olan klonları seçin.
Seçilen klonlardan toplam RNA ayıklayın ve ücretsiz DNA sentezi yapın. RNA'yı el yazması yönlere göre bir poly-T astarı ve dNTP'lerle karıştırın ve 65 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu en az bir dakika buzun üzerine yerleştirin.
Reaksiyona 10 mikrolitre cDNA sentezi karışımı ekleyin. Daha sonra numuneyi 50 derecede 50 dakika, 85 santigrat derece de bir termocycler'da beş dakika kuluçkaya yatırın. CDNA sentezinden sonra, numuneleri bir mikrolitre RNase H ile tedavi edin ve 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Tasarım astarları ve TaqMan probları özellikle alternatif organizatörlerden oluşturulan bireysel transkript varyansı için ve plazmid DNA içine belirli transkript dizilerini içeren DNA parçalarını klonlamak. Transkript niceleme için standart eğriler olarak rekombinant plazmidlerin on kat seyreltme serisini yapın. Her örnek için 20 mikrolitre PCR karışımı hazırlayın ve el yazması talimatlara göre gerçek zamanlı PCR çalıştırın.
Sonuçları analiz edin ve her örnekteki hedef transkriptlerin kopya numarasını bir temizlik geni ile normalleştirin. Bu protokol RUNX1 intronic susturucuyu silmek için başarıyla kullanılmıştır ve deletion kılcal jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. Yabani tip ve mutant PCR ürünlerinin beklenen boyutları sırasıyla yaklaşık 500 baz çifti ve 230 baz çifti vardır.
Dekolte bölgelerinde oluşan indels nedeniyle mutant ürünlerin boyutu klonlar arasında değişebilir. Silmelerin kimliğini doğrulamak için sanger sıralaması kullanıldı. RUNX1 geni iki promotör içerir, P1 ve P2 üç büyük mRNA transkript üretti: P1 tarafından RUNX1c, ve RunX1a ve RUNX1b P2 tarafından. Susturucu öğesinin silinmesinin bu transkriptlerin ifadesini nasıl etkilediğini belirlemek için gerçek zamanlı nicel PCR kullanılabilir.
CRISPR RNA'ların iyi bir tasarımı, deneyin değerlendirilmesi açısından önemlidir. CRSIPR RNA'nın amaçlanan silme bölgesine yakın şekilde paketlendiğinden emin olun. Ayrıca, Cas9 tanıma için hedef dizinin aşağısında bir PAM dizisinin bulunduğundan emin olun.
CrE'leri incelemenin yanı sıra, bu strateji gen konum çalışmaları için kullanılabilir ve gen fonksiyonlarını incelemek için RNA girişimine alternatif olarak hizmet vermektedir. Kromozom konformasyon yakalama teknikleri ile birleştirerek CRISPR kesinlikle değiştirilmiş genom organizasyonu ve kanser gibi çeşitli sağlık sorunları ile bağlantılı gen ekspresyonu CREs tutulumlarını deşifre yardımcı olacaktır.
