促进剂和增强剂等 Cis 调控元素是基因表达的关键决定因素。研究这些元素的传统方法非常费力，并且经常涉及使用异质记者基因。在这里，我们演示了CRISPR在白血病细胞系中检查R运行X1内电子消音器的转录作用。
该协议执行简单，允许在内源基因环境中快速评估基因调控功能。造血细胞通常很难通过质粒基方法转染。在该协议中，我们使用电穿孔将预组装的Cas9、引导RNA、复合物传递到细胞中。
这种方法的优点包括使用改进的编辑效率和细胞生存能力，以及减少目标外效果。此外，随后使用片段分析可以简单、快速地筛选大量样本中所需的突变克隆。演示程序将是余林荣，我的实验室技术员。
首先设计两个CRISPRRNA，一个五个最主要，另一个目标 cis 调控元素的三个最主要元素，或 CRE。确保 NGG 的 PAM 位于 Cas9 识别的目标序列的正下游。要形成 gRNA 复合物，请根据手稿方向将CRISPR RNA和示踪剂RNA结合在TE缓冲液中，最终双面浓度为44微摩尔。
在95摄氏度下孵育混合物5分钟，让其冷却至室温。用PBS稀释重组的Cas9核酸酶，最终核酸酶浓度为36微摩尔。然后将稀释的核酸酶与每种 gRNA 双工混合等量，并在室温下孵育20分钟，使 RNP 复合物形成。
将250万个细胞在1.5毫升管中以500倍g离心5分钟。然后丢弃上流水，在RPMI 1640介质的163微升中重新悬浮细胞，不带酚红色。将 16.7 微升的 RNP 复合物和 3.6 微升的 100 微摩尔电穿孔增强剂添加到细胞中，并将混合物转移到 0.2 厘米间隙电穿孔盒中，注意不要引入任何气泡。
电分细胞，并转移到T-25组织培养瓶包含6毫升的完整RPMI 1640介质。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞。电穿孔后一天，在完整的RPMI 1640介质中稀释细胞至每毫升5000个细胞。
并将100微升细胞悬浮液加入96井组织培养板的每个井中。培养细胞7至14天，然后使用高通量纯化系统提取基因组DNA。在96井萃取板的每个井中加入100微升的板结合和解液缓冲液，随后在10微升PBS中重新悬浮5万个细胞。
通过上下移液混合井内。在室温下孵育板30分钟，使基因组DNA与井结合。然后小心地从井中吸出溶液，然后用120微升的洗涤缓冲液清洗。
空气干燥板。在每个井中添加 20 微升 PCR 混合物，然后根据手稿指示运行 PCR。放大完成后，通过用荧光计测量所选样品的浓度来估计产品量。
用无核酸酶水稀释所有样品至每微升0.5纳米。将稀释 PCR 产品的一微升与 8.5 微升的去离子甲酰胺和 0.5 微升荧光染料标记尺寸标准混合在与遗传分析仪兼容的 96 井板中。用板隔膜盖住盘子，在95摄氏度下使样品在热循环器中变性三分钟。
执行毛细管电泳以分离标记的 PCR 产品，并分析分析软件上的结果。检查橙色图标以查看标记的片段和大小标准，以评估大小调用的质量。然后，检查蓝色图标以查看标记的 PCR 产品。
确定与野生类型和突变产品对应的峰，通过将突变峰下的区域除以野生型峰和突变峰下的区域之和来估计每个样本中的突变水平。选择多个具有高预期删除级别的单元池，以进一步进行串行稀释。重复DNA提取、荧光PCR和毛细管电泳步骤，并选择突变水平大于95%的克隆进行后续分析。
从选定的克隆中提取总RNA，并进行免费DNA合成。根据手稿方向将RNA与多T底土和dNTP混合，在65摄氏度下孵育5分钟。然后，将反应放在冰上至少一分钟。
在反应中加入十微升的cDNA合成混合物。然后在50摄氏度下孵育样品50分钟，在热循环器中孵育5分钟。cDNA合成后，用一微升RNase H处理样品，并在37摄氏度下孵育20分钟。
设计底剂和TaqMan专门针对从替代启动子生成的单个转录表方差进行检测，并克隆含有特定转录序列的DNA片段，并克隆成质粒DNA。制作重组质粒的十倍稀释系列，作为转录量的标准曲线。为每个样品准备 20 微升 PCR 混合物，并根据手稿指示运行实时 PCR。
分析结果，用家政基因使每个样本中目标转录本的拷贝数正常化。该协议已成功用于删除 RUNX1 电子消音器，并且使用毛细管凝胶电泳确认删除。野生型和突变PCR产品的预期大小分别是约500个碱基对和230个碱基对。
突变产品的大小可能因克隆体而异，因为在裂解点形成 indel。桑格测序用于确认删除的标识。RUNX1基因包含两个启动子，P1和P2，它们产生三个主要的mRNA转录：运行X1c（P1）和R跑去1a和R运行X1b（P2）。实时定量 PCR 可用于确定消音器元素的删除如何影响这些脚本的表达。
CRISPRRNA的一个好的设计对于它对实验进行评估非常重要。确保CRSIPR RNA与预定的删除区域紧密包装。此外，请确保与 PAM 序列位于 Cas9 识别的目标序列的下游。
除了研究CRÉ，此策略可用于基因定位研究，并作为RNA干扰的替代方案，以检查基因功能。通过结合染色体构象捕获技术CRISPR，肯定有助于破译CR参与改变的基因组组织和基因表达与癌症等各种健康问题相关的基因表达。
