Primaquina es un conocido medicamento antipalúdico. La determinación de primaquina en fluidos biológicos a menudo es necesaria para evaluar la farmacocinética. Actualmente, las principales técnicas para la determinación de primaquinas se basan en HPLC.
Los procedimientos de HPLC pueden ser bastante complicados y llevar mucho tiempo. Así que este método ofrece una forma sencilla para la detección rápida de Primaquine. Este método Griess es potencialmente la forma más simple y rentable para la cuantificación de Primaquinas.
Además, este método puede ofrecer posibilidades para la detección de Primaquinas a simple vista sin la necesidad de ningún equipo. Además de las muestras de suero y orina, este método también podría utilizarse para determinar cuantitativamente Primaquine en formulaciones farmacéuticas, por ejemplo, la determinación de Primaquina en tabletas para el control de calidad de fabricación. Wu Yalan y Wu Shengjun, dos estudiantes graduados de mi laboratorio.
Comience por disolver 0,1 milimoles de anilina y bifosfato de primaquina en 10 mililitros de 5% de solución de ácido fosfórico en un matraz inferior marrón de 25 mililitros. Coloque el matraz en un baño de hielo y agregue una barra de agitación. A continuación, coloque el baño de hielo en un plato de agitación.
Disolver 6,9 miligramos de nitrato de sodio y un mililitro de agua enfriada y añadirlo al matraz en cuanto a gota. Retire el baño de hielo y mantenga la mezcla de reacción revolviendo a temperatura ambiente. Supervise la reacción con una cromatografía de capa fina o placa TLC recubierta de gel de sílice, utilizando una mezcla de metanol de diclorometano como eluyente.
El producto azo exhibe manchas de color en la placa TLC. Detenga la reacción cuando desaparezcan las manchas PMQ. Ajuste el pH de la mezcla de reacción a más de 10 añadiendo solución de hidróxido de sodio a un baño de hielo.
A continuación, utilice un embudo de separación de 50 mililitros para extraer la mezcla tres veces con 20 mililitros de acetato de etilo por extracción. Cuando haya terminado, combine y concentre la fase orgánica al vacío utilizando un evaporador rotatorio. Purificar los residuos utilizando cromatografía flash con gel de sílice de fase inversa bajo presión normal.
A continuación, seque la solución mediante liofilización para obtener el producto azote deseado. Para medir los espectros de absorción de VIS UV, disolver el azo puro en agua destilada o 5%ácido fosfórico, y utilizar el espectrofotómetro para registrar los espectros de absorción a temperatura ambiente. Para medir la absorción de PMQ, comience disolviendo 4-metoxianilina en cloruro de hidrógeno molar 0.2 para una solución de anilina de 200 mililitros.
A continuación, disuelva el nitrito de sodio en agua destilada para obtener cinco solución milimolar. Mantenga las soluciones a cuatro grados centígrados. Agregue 100 microlitros de la solución de anilina a una placa de 96 pozos.
A continuación, agregue 50 microlitros de la muestra que contiene PMQ y mezcle con la anilina. Añadir 50 microlitros de la solución de nitrito de sodio a la placa, y mezclar el contenido por pipeteo. Mantenga la placa a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, mida la absorbancia de la solución a 504 nanómetros.
Exporte los datos como un archivo de hoja de cálculo para su posterior análisis. Para construir una curva de calibración para mediciones de PMQ en muestras de orina, prepare soluciones PMQ en orina sintética a concentraciones de cero, uno, dos, cinco, 10, 20, 50, 100 y 200 micromolares. Prepare la reacción de detección de PMQ y mida la absorbancia como se describió anteriormente.
A continuación, genere una curva de calibración basada en la absorbancia de 504 nanómetros y las concentraciones de PMQ. Restar los valores de absorbancia de las muestras sin PMQ de las mediciones de prueba, y realizar un ajuste lineal para generar una ecuación lineal y es igual a x más b, donde y es la absorbancia y la tensión, y x es la concentración de PMQ. Para construir una curva de calibración para la medición de PMQ en muestras de suero humano, prepare soluciones PMQ en suero humano con concentraciones de PMQ de cero, uno, dos, cinco, 10, 20, 50, 100 y 200 micromolares.
Prepare la reacción PMQ. Mida la absorbancia y construya la curva de calibración como se describió anteriormente. Agregue seis mililitros de hexano de acetato de etilo en dos mililitros de suero que contenga PMQ en un tubo centrífugo de 15 mililitros.
Añadir 100 microlitros de dos soluciones molares de hidróxido de sodio al sistema de extracción, y vórtice el tubo durante 30 segundos. Luego, recoja la capa orgánica y concentre con un evaporador rotatorio al vacío. Disolver el residuo en 200 microlitros de agua destilada y filtrar a través de una membrana en forma de disco de 220 nanómetros del tamaño de un poro para eliminar los componentes lipídicos insolubles.
Construir la curva de calibración para PMQ en agua destilada, luego preparar una reacción de detección con la solución extraída en una placa de 96 pozos como se describió anteriormente, y medir la absorbancia. A continuación, determine la concentración de PMQ de acuerdo con la ecuación lineal de la curva de calibración. Las condiciones de reacción se optimizaron mediante el uso de varias líneas de anilinas para acoplarse con PMQ a través de la reacción de Griess.
Se realizaron cálculos teóricos, y los resultados estuvieron de acuerdo con las mediciones ópticas. Se determinó que la 4-metoxianilina era óptima para la reacción de detección de PMQ, debido a su buen rendimiento y tasa de reacción, solubilidad del producto y estabilidad. Por otra parte, el producto azo para 4-metoxianilina es de color rojo, que es fácil de distinguir con los ojos desnudos.
Se probaron los efectos del pH en la absorción UV del producto azo y de las soluciones PMQ. Si bien el aumento del pH de 1,0 a 7,0 no cambia la absorbancia, el pH básico tiene un efecto significativo. Se construyeron curvas de calibración para la detección de PMQ en muestras de orina y suero.
Se encontró una relación lineal cuando el PMQ oscila entre cero y 200 micromolares en orina, y de 10 a 200 micromolares en suero. Para simular un suero real que contiene PMQ, PMQ se añadió en suero humano a 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 concentraciones micromolares. Usando este protocolo, se encontró que las concentraciones recuperadas eran 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 y 1,78 micromolares, lo que resultó en una recuperación del 90% para concentraciones superiores a 0,5 micromolares.
Cabe señalar que el tiempo para que la reacción alcance su intensidad saturada depende de la temperatura. Normalmente, 10 a 20 minutos es suficiente para la temperatura entre 20 a 30 grados centígrados. Sin embargo, para concluir nuestro ejemplo de química de duelo para la detección de primaquinas.
Diseño similar también es adecuado para otras moléculas relevantes que tienen una reactividad química similar a la primaquina.
