프리마퀸은 잘 알려진 말라리아 약물입니다. 생물학적 유체에서 primaquine의 결정은 종종 약동학을 평가하기 위하여 요구됩니다. 현재 Primaquine 결정의 주요 기술은 HPLC를 기반으로 합니다.
HPLC의 절차는 매우 복잡하고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 따라서 이 방법은 Primaquine을 신속하게 감지할 수 있는 간단한 방법을 제공합니다. 이 Griess 방법은 잠재적으로 Primaquine 정량화를 위한 가장 간단하고 비용 효율적인 방법입니다.
또한,이 방법은 어떤 장비의 요구 없이 육안으로 프리마퀸 검출을 위한 가능성을 제공할 수 있습니다. 혈청 과 소변 샘플 외에, 이 방법은 또한 정제 품질 관리를 위한 정제에 있는 Primaquine의 결정, 예를 들면, 약제 제형에 있는 Primaquine를 정량적으로 결정하는 것을 이용될 수 있었습니다. 절차를 시연하는 것은 미스 우 얄란과 우 성준, 내 실험실에서 두 대학원생이 될 것입니다.
25 밀리리터 브라운 바닥 플라스크에서 5%의 인산 용액의 10 밀리리터로 애니라인과 프리마퀸 비포스페이트0.1 밀리몰을 용해시세요. 플라스크를 얼음 욕조에 넣고 저어바를 추가합니다. 그런 다음 얼음 목욕을 교반 접시에 놓습니다.
질산 나트륨 6.9 밀리그램과 냉각된 물 1밀리리터를 녹여 플라스크 드롭와이즈에 추가합니다. 얼음 목욕을 제거하고 상온에서 교반 반응 혼합물을 유지합니다. 용액으로 디클로로메탄 메탄올 혼합물을 사용하여 실리카 겔 코팅, 얇은 층 크로마토그래피 또는 TLC 플레이트로 반응을 모니터링합니다.
아조 제품은 TLC 플레이트에 색이 있는 반점을 전시합니다. PMQ 스팟이 사라지면 반응을 중지합니다. 얼음 목욕에 수산화 나트륨 용액을 추가하여 반응 혼합물의 pH를 10 이상으로 조정합니다.
그런 다음 50 밀리리터 분리 깔때기를 사용하여 추출 당 20 밀리리터의 20 밀리리터로 혼합물을 세 번 추출합니다. 완료되면 회전 증발기로 유기상을 진공 상태에서 결합하고 농축합니다. 정상 압력하에서 역상 실리카 젤로 플래시 크로마토그래피를 사용하여 잔류물을 정화합니다.
이어서, 원하는 아조 제품을 얻기 위해 용액을 건조하게 한다. UV 비스 흡수 스펙트럼을 측정하려면 증류수 또는 5%인산에 순수 아조를 용해시키고 분광광계를 사용하여 실온에서 흡수 스펙트럼을 기록합니다. PMQ 흡수를 측정하려면 200 밀리알러 애니라인 용염수소용 0.2 개의 어금니 수소염화에서 4-메톡소니라인을 용해시게 하십시오.
그런 다음 증류수에 아질산나트륨을 녹여 5밀리머 용액을 얻습니다. 솔루션을 섭씨 4도까지 유지하십시오. 96웰 플레이트에 애니라인 용액 100마이크로리터를 추가합니다.
그런 다음 PMQ 함유 샘플의 50 마이크로리터를 추가하고 애니라인과 혼합합니다. 나트륨 아질산염 용액 50 마이크로리터를 접시에 넣고 파이펫팅하여 내용을 혼합합니다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 유지한 다음 용액의 흡광도를 504나노미터로 측정합니다.
추가 분석을 위해 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 소변 샘플에서 PMQ 측정을 위한 교정 곡선을 구성하려면 0, 2, 5, 10, 20, 50, 100 및 200 마이크로몰러 의 농도에서 합성 소변에서 PMQ 솔루션을 준비합니다. PMQ 검출 반응을 준비하고 이전에 설명한 대로 흡광도를 측정합니다.
그런 다음 504 나노미터 흡광도 및 PMQ 농도를 기반으로 교정 곡선을 생성합니다. 시험 측정에서 PMQ 없이 샘플의 흡광도 값을 빼고 선형 맞춤을 수행하여 선형 방정식 y를 생성하여 x 플러스 b와 같으며, 여기서 y는 흡광도 및 긴장이며 x는 PMQ의 농도이다. 인간 혈청 샘플에서 PMQ 측정을 위한 교정 곡선을 구성하려면 PMQ 농도가 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 및 200 마이크로몰러인 인간 혈청의 PMQ 솔루션을 준비합니다.
PMQ 반응을 준비합니다. 흡수도를 측정하고, 이전에 설명한 대로 교정 곡선을 구성한다. 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 PMQ 함유 세럼 2밀리리터에 7~1개의 에틸 아세테이트 헥산6밀리리터를 넣습니다.
2개의 어금니 나트륨 수산화용액100마이크로리터를 추출 시스템에 추가하고 30초 동안 튜브를 소용돌이시다. 그런 다음 유기 층을 수집하고 진공 상태에서 회전 증발기로 농축합니다. 잔류물을 증류수 200마이크로리터에 녹이고, 220나노미터 의 모공 크기의 멤브레인을 통해 여과하여 불용성 지질 성분을 제거합니다.
증류수에서 PMQ용 교정 곡선을 구성한 다음, 이전에 설명한 대로 추출된 용액을 96웰 플레이트로 검출 반응을 준비하고 흡수도를 측정합니다. 그런 다음 교정 곡선으로부터 선형 방정식에 따라 PMQ의 농도를 결정합니다. 반응 조건은 Griess 반응을 통해 PMQ와 결합하는 다양한 애니라인을 사용하여 최적화되었습니다.
이론적 계산이 수행되었고, 그 결과는 광학 측정과 양호한 일치했다. 4-메톡시애니린은 좋은 성능과 반응 속도, 제품 용해도 및 안정성으로 인해 PMQ 검출 반응에 최적이라고 판단되었습니다. 또한, 4-메톡소니린을 위한 아조 제품은 붉은 색으로, 육안으로 구별하기 쉽다.
아조 제품 및 PMQ 용액의 UV 바이 스흡수에 대한 pH의 효과를 테스트했습니다. pH를 1.0에서 7.0으로 늘리면 흡수도가 변하지 않지만 기본 pH는 상당한 영향을 미칩니다. 교정 곡선은 소변 및 혈청 샘플에서 PMQ의 검출을 위해 구성되었다.
PMQ가 소변에서 0에서 200 마이크로몰러, 혈청에서 10에서 200 마이크로몰러범위때 선형 관계가 발견되었습니다. 실제 PMQ 함유 혈청을 시뮬레이션하기 위해 PMQ는 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 마이크로몰라 농도로 인간 혈청에 추가되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 회수된 농도는 0.02, 0.14, 0.44, 0.90 및 1.78 마이크로몰러로 나타났으며, 그 결과 0.5 마이크로몰라 이상의 농도에 대해 90%의 회복이 초래되었다.
반응의 포화 강도에 도달하는 시간은 온도에 따라 달라집니다. 일반적으로 10~20분은 섭씨 20~30도 사이의 온도에 충분합니다. 그러나, 프리마퀸 검출을 위한 Griess 화학의 우리의 예를 결론.
유사한 디자인은 또한 프리마퀸과 유사한 화학 반응성을 가진 그밖 관련 분자에 적합합니다.
