Primaquine est un médicament antipaludique bien connu. La détermination de la primaquine dans les fluides biologiques est souvent nécessaire pour évaluer la pharmacocinétique. Actuellement, les principales techniques de détermination primaquine sont basées sur HPLC.
Les procédures de HPLC peuvent être assez compliquées et longues. Ainsi, cette méthode offre un moyen simple pour la détection rapide de Primaquine. Cette méthode Griess est potentiellement le moyen le plus simple et le plus rentable pour la quantification primaquine.
En outre, cette méthode peut offrir des possibilités de détection primaquine à l’œil nu sans l’exigence d’aucun équipement. Outre les échantillons de sérum et d’urine, cette méthode pourrait également être utilisée pour déterminer quantitativement primaquine dans les formulations pharmaceutiques, par exemple, la détermination de primaquine dans les comprimés pour la fabrication de contrôle de la qualité. Mlle Wu Yalan et Wu Shengjun, deux étudiants diplômés de mon labo, feront la démonstration de la procédure.
Commencez par dissoudre 0,1 millimoles de biphosphate d’aniline et de primaquine en 10 millilitres de solution d’acide phosphorique de 5 % dans une fiole brune de fond de 25 millilitres. Mettre le flacon sur un bain de glace et ajouter une barre de remue-glace. Ensuite, mettez le bain de glace sur une plaque à remuer.
Dissoudre 6,9 milligrammes de nitrate de sodium et un millilitre d’eau refroidie et l’ajouter à la fiole goutte-sage. Retirer le bain de glace et garder le mélange de réaction en remuant à température ambiante. Surveillez la réaction à l’aide d’une chromatographie ou d’une plaque TLC recouverte d’un gel de silice, à l’aide d’un mélange de méthanol dichloromethane comme élitente.
Le produit azo présente des taches colorées sur la plaque TLC. Arrêtez la réaction lorsque les taches PMQ disparaissent. Réglez le pH du mélange de réaction à plus de 10 en ajoutant une solution d’hydroxyde de sodium à un bain de glace.
Ensuite, utilisez un entonnoir de séparation de 50 millilitres pour extraire le mélange trois fois avec 20 millilitres d’acétate d’éthyle par extraction. Une fois terminé, mélanger et concentrer la phase organique sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif. Purifier les résidus à l’aide d’une chromatographie flash avec du gel de silice de phase inverse sous pression normale.
Ensuite, séchez la solution par lyophilisation pour obtenir le produit azo désiré. Pour mesurer les spectres d’absorption des vis UV, dissoudre l’azo pur dans de l’eau distillée ou de l’acide phosphorique à 5 %, et utiliser le spectrophotomètre pour enregistrer les spectres d’absorption à température ambiante. Pour mesurer l’absorption du QPM, commencez par dissoudre la 4-méthoxyaniline dans du chlorure d’hydrogène molaire de 0,2 molaire pour une solution aniline de 200 millimlaires.
Dissoudre ensuite le nitrite de sodium dans l’eau distillée pour obtenir une solution de cinq millimolaires. Gardez les solutions à quatre degrés Celsius. Ajouter 100 microlitres de la solution aniline à une plaque de 96 puits.
Ajouter ensuite 50 microlitres de l’échantillon contenant du QPM et mélanger avec l’aniline. Ajouter 50 microlitres de la solution de nitrite de sodium à l’assiette, et mélanger le contenu par pipetting. Gardez la plaque à température ambiante pendant 15 minutes, puis mesurez l’absorption de la solution à 504 nanomètres.
Exportez les données en tant que fichier de feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Pour construire une courbe d’étalonnage pour les mesures de QPM dans les échantillons d’urine, préparez des solutions de QPM dans l’urine synthétique à des concentrations de zéro, un, deux, cinq, 10, 20, 50, 100 et 200 micromolaires. Préparez la réaction de détection du QPM et mesurez l’absorption telle qu’elle a été décrite précédemment.
Ensuite, générer une courbe d’étalonnage basée sur l’absorption de 504 nanomètres et les concentrations de QPM. Soustrayez les valeurs d’absorption des échantillons sans QPM des mesures d’essai, et effectuez un ajustement linéaire pour générer une équation linéaire y égale x plus b, où y est l’absorption et la tensité, et x est la concentration de PMQ. Pour construire une courbe d’étalonnage pour la mesure du QPM dans les échantillons de sérum humain, préparez des solutions de QPM dans le sérum humain avec des concentrations de QPM de zéro, un, deux, cinq, 10, 20, 50, 100 et 200 micromolaires.
Préparez la réaction du PQ. Mesurez l’absorption et construisez la courbe d’étalonnage telle qu’elle a été décrite précédemment. Ajouter six millilitres de sept à un hexane d’acétate d’éthylique en deux millilitres de sérum contenant du QPM dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Ajouter 100 microlitres de deux solutions molaires d’hydroxyde de sodium au système d’extraction, et vortex le tube pendant 30 secondes. Ensuite, recueillir la couche organique et la concentrer avec un évaporateur rotatif sous vide. Dissoudre les résidus dans 200 microlitres d’eau distillée et filtrer à travers une membrane poreuse de 220 nanomètres en forme de disque pour éliminer les composants lipidiques insolubles.
Construire la courbe d’étalonnage pour pmq dans l’eau distillée, puis préparer une réaction de détection avec la solution extraite dans une plaque de 96 puits comme décrit précédemment, et mesurer l’absorption. Ensuite, déterminer la concentration de PMQ en fonction de l’équation linéaire de la courbe d’étalonnage. Les conditions de réaction ont été optimisées en utilisant diverses anilines pour coupler avec PMQ par la réaction de Griess.
Des calculs théoriques ont été effectués, et les résultats étaient en bon accord avec les mesures optiques. Il a été déterminé que la 4-méthoxyaniline était optimale pour la réaction de détection de PMQ, en raison de sa bonne performance et taux de réaction, solubilité de produit, et stabilité. En outre, le produit azo pour 4-methoxyaniline est de couleur rouge, qui est facile à distinguer avec les yeux nus.
Les effets du pH sur les UV vis-à-vis de l’absorption du produit azo et des solutions PMQ ont été testés. Bien que l’augmentation du pH de 1,0 à 7,0 ne modifie pas l’absorption, le pH de base a un effet significatif. Des courbes d’étalonnage ont été construites pour la détection du QPM dans les échantillons d’urine et de sérum.
Une relation linéaire a été trouvée quand PMQ varie de zéro à 200 micromolar dans l’urine, et de 10 à 200 micromolar dans le sérum. Pour simuler un véritable sérum contenant du QPM, le QPM a été ajouté dans le sérum humain à 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 concentrations de micromolaires. En utilisant ce protocole, les concentrations récupérées se sont trouvées à 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 et 1,78 micromolaire, ce qui a entraîné une récupération de 90 % pour les concentrations de plus de 0,5 micromolaire.
Il convient de noter que le temps nécessaire pour que la réaction atteigne son intensité saturée dépend de la température. Normalement, 10 à 20 minutes est suffisant pour la température entre 20 à 30 degrés Centigrades. Cependant, pour conclure notre exemple de la chimie de Griess pour la détection de primaquine.
Une conception similaire convient également à d’autres molécules pertinentes qui ont une réactivité chimique similaire à celle de la primaquine.
