Esta técnica es una forma confiable de entregar cualquier contenido, como medicamentos, proteínas o células, a lugares específicos en tejidos o animales. Puede realizar un seguimiento de la entrega y ajustar la liberación de los contenidos para que se ajusten al experimento que desee. Se puede utilizar para tratar numerosas enfermedades, desde la cicatrización de heridas hasta enfermedades oculares y cardíacas.
La principal ventaja de este método es la capacidad de entregar células terapéuticas utilizando microcápsulas de alginato a los sitios de destino sin causar reacciones inmunitarias y mantener una entrega sostenida de terapias frescas secretas durante un período de tiempo más largo. Comience por cultivar células epiteliales de la retina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Pasaje de las células cuando lleguen a 70 a 80% de confluencia utilizando procedimientos estándar de cultivo de tejido.
Para encapsular las células, mezcle el alginato de sodio con agua desionizada para una concentración final de 2% de peso al volumen y purifique la mezcla mediante filtración con un filtro de jeringa estéril de 0,2 micrómetros. Pruebe, centrifugar y lave las células con 10 solución salina tamponada HEPES milimétrica. Utilice un hemocitociómetro para contar las células y ajustar la concentración celular final a un millón por mililitro de solución de alginato.
Cargue 300 microlitros alícuotas de la mezcla de alginato y células en una jeringa de tres mililitros y adjúntela a una bomba de jeringa. Prepare un baño gelificante de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y colóquelo en un vaso de precipitados estéril de 50 mililitros debajo de la punta de la jeringa a una aguja de siete milímetros a una distancia de pulverización de baño. Ajuste el voltaje a ocho kilovoltas y el caudal a 30 milímetros por hora para producir microcápsulas de aproximadamente 150 micrómetros de tamaño.
Conecte el clip de tierra negro al cable de cobre que está medio sumergido en el baño de gelificación y conecte el clip del cable de ánodo rojo a la aguja. Se tarda aproximadamente 30 minutos en preparar las células encapsuladas de cada lote de un mililitro del alginato y la mezcla celular. Cuando se forme, lave las microcápsulas con solución de lavado dos veces e incubarlas con un 10%de FBS suplementado con DMEM en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y 5% de CO2.
Después de una incubación de 24 horas, prepare una muestra de 500 microlitros de microcápsulas para su tinción lavándolos dos veces en la solución de lavado. Utilice un kit de ensayo LIVE/DEAD para mancharlos por viabilidad. Para asegurarse de que las microcápsulas tienen el tamaño adecuado, diluyalas en medios libres de suero.
Aspirar cuidadosamente con una jeringa Hamilton de 2,5 microlitro. Expulse lentamente un microlitro cae sobre un portaobjetos del microscopio y determina la integridad de las microcápsulas con un microscopio Vertical Brightfield. En un ratón adecuadamente anestesiado, aplique lubricante ocular para mantener la humedad ocular y utilice una aguja de jeringa biselada de 26 calibres 3/8 pulgadas para establecer una punción inicial en el ojo justo debajo del limbo.
Asegúrese de acercarse al ojo desde una dirección nasal en un ángulo de 45 grados manteniendo la punta biselada hacia arriba para evitar la perforación de la lente. A continuación, asegúrese de que toda la punta de la aguja se inserta en el ojo para la generación de orificios guía, pero tenga cuidado de no viajar demasiado lejos y perforar la retina temporal. Una vez que esto esté completo, retraiga lentamente la aguja.
Dentro del micromaniprógrafo, coloque una jeringa Hamilton de punta contundente de calibre 27 de 2,5 microlitro que se haya llenado con solución de cápsula y alinee la aguja con el orificio guía inicial. Sostenga la cabeza del animal en una posición estable y maneje deliberadamente la aguja hacia el ojo. Para asegurar una posición correcta de la aguja dentro del vítreo, inserte la jeringa hasta que la punta de la aguja se pueda visualizar detrás de la lente.
A continuación, inyecte la solución de la cápsula lentamente en el transcurso de 25 a 30 segundos. Y una vez completada, retraiga gradualmente la jeringa de punta contundente para minimizar la lesión en el ojo. Si es necesario, ajuste el tamaño de la cápsula ajustando el voltaje y el caudal de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
La encapsulación de las células en el alginato se confirmó con imágenes de Brightfield y un ensayo LIVE/DEAD demostró que el 90% de las células eran viables después de la encapsulación. La viabilidad a largo plazo de las células se aseguró disolviendo las cápsulas en citrato de sodio y replating. La inyección intravítrea se realizó bajo inspección visual que permitió la visualización de cápsulas en el vítreo.
Al intentar este procedimiento, no utilice PBS para ningún paso de lavado porque PBS disuelve las microcápsulas de alginato formadas. Después de su desarrollo, nuestro laboratorio se utiliza como un sistema de administración para tratar formas de insuficiencia cardíaca e hipertensión. Esta técnica se considera una herramienta prometedora para el tratamiento futuro de diferentes enfermedades cardiovasculares y neurológicas.
