Este trabajo es apoyado por el programa Rowland junior becario. Los autores desean expresar su agradecimiento a los científicos y el personal del Instituto Rowland en Harvard: Chris Stokes por su ayuda en el desarrollo de la, la configuración de control de presión asistida por computadora hecha a la medida, Diane Schaak, Ph.D. por su aportación para la manipulación de la muestra biológica, Winfield Hill por el desarrollo de la instalación eléctrica, Alavaro Sánchez, Ph.D. para conceder el acceso a la citómetro de flujo, Scott Bevis, Kenny Spencer y Don Rogers para el mecanizado de componentes de plomería mecánicos necesarios para la configuración de presión. Maestros de microfluidos fueron fabricados en el Centro de Sistemas de nanoescala (CNS) de la Universidad de Harvard.

1. Preparación de la célula <ol><li> Placa 1 × 10 5 células / ml de metastásico línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 en un volumen de 10 ml por matraz de cultivo tisular T75 en de Leibovitz L-15 suplementado con 10% (v / v) de suero fetal bovino y 1 % de penicilina-estreptomicina. </li><li> Incubar MDA-MB-231 células en un incubador humidificado a 37 ° C con 0% de CO 2 medio ambiente. </li><li> Cosecha células para los experimentos de 2 días después de la siembra por tratamiento de las células con 0,25% de tripsina-EDTA durante 2 min e inactivar la actividad enzimática de tripsina mediante la adición de 8 ml de medio de crecimiento. </li><li> Precipitar las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g y resuspender en tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS, 1x, sin Ca2 + y Mg2 +) a una concentración final de 5 × 10 5 células / ml. </li></ol> 2. Diseño y fabricación de dispositivos NOTA: La máscara, las fabricaciones de molde maestro y elproceso que la contiene microcanal se lleven a cabo dentro de una habitación limpia mientras que el proceso de fundición microcanal polidimetilsiloxano (PDMS) se puede realizar en una mesa de trabajo de laboratorio habitual. <ol><li> Diseñar un dispositivo de microfluidos como se ilustra en la Figura 1 con AutoCAD. El dispositivo debe consistir en una entrada con múltiples puertos de inyección, filtros gruesos y dos canales rectangulares rectas paralelas inerciales de enfoque (L = 7 mm, W = 40 m, y H = 70 m). Canal recto individual consta de 5 cámaras de electroporación, que se colocan 800 micras de separación (W C = 400 m) con dos agujeros a través de los electrodos de aluminio. Dos cámaras de electroporación transversalmente adyacentes comparten el agujero para el electrodo negativo. Dos canales rectos se funden en una salida en la región aguas abajo de la electroporación. </li><li> Convertir el archivo CAD con micro-patrones en un archivo GDSII usando LinkCAD. Escriba los micro-patrones en un 5 &quot;x 5&quot; fotomáscara en blancousando un escritor máscara de láser. Desarrollar la máscara siguiendo el protocolo del fabricante. NOTA: El proceso de desarrollo de máscara incluye desarrollo fotoprotector, grabado cromo y resistir la retirada. Alternativamente, micro-patrones impresos en una transparencia alta resolución (&gt; 20.000 dpi) se pueden comprar a partir de un fabricante de terceros y se utiliza como una fotomáscara. Características a microescala finales sobre una fotomáscara deben ser transparentes para que coincida con la polaridad de un fotoprotector negativo. </li><li> Fabricar el molde de colada del diseño del dispositivo utilizando técnicas de litografía suave estándar 23 con una capa fotorresistente negativo giró sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas a 2.000 rpm para tener el espesor final de 70 micras. </li><li> Precocción la oblea con fotorresistencia negativa durante 20 min a 95 ° C. </li><li> Póngase en contacto con la máscara con la oblea y exponer a una fuente de UV (17,4 mJ / cm 2) durante 80 segundos utilizando un alineador de máscara. </li><li> Desarrollar la oblea expuesta durante 4 minutos en un desarrollador de SU-8. </li><li> Mida laespesor fotoprotector desarrollada usando un perfilómetro de superficie. </li><li> Mezclar con rigor una proporción de 10: 1 de elastómero de agente (kit de elastómero de silicona) curar y verter la mezcla en el molde de fundición para generar réplicas de PDMS. Desgasificar el elastómero de colada durante 30 min y curar el molde de fundición con elastómero desgasificada en un horno a 70 ° C durante 2 horas. </li><li> Delaminarse curado réplica de PDMS con patrones de microcanales de los orificios del molde y punzón para las entradas, salida y electrodos inserciones utilizando una prensa de tornillo pasador. NOTA: El diámetro normal borde de corte de la prensa de tornillo pasador debe ser 0,76 mm, adecuada para la fuerza que sostiene tubo de PEEK (OD de 1/32 &quot;) y electrodos de aluminio (OD de 0,029&quot;) en su lugar. </li><li> Crear canales de microfluidos encerrada por unión PDMS réplicas a un portaobjetos de vidrio tratado en un limpiador de oxígeno-plasma durante 7 s a una potencia y presión parcial de oxígeno de radiofrecuencia de 75 W y 500 mTorr, respectivamente. </li></ol> 3. experimentos de flujo <ol><li> Insertarelectrodos de aluminio (0,029 &quot;OD) y un tubo de PEEK de salida (1/32&quot; OD) en los lugares designados a través de agujeros en las microcanal (véase la Figura 3B). </li><li> Conectar el equipo eléctrico 18 responsable de la generación de alta tensión impulsos cortos de onda cuadrada a los electrodos de aluminio (véase la Figura 3C) que están en contacto con soluciones que fluye en el molde de PDMS. NOTA: El equipo debe constar de un generador de impulsos y un amplificador de alto voltaje construido en la casa 18. </li><li> Preparar cuatro tubos de centrífuga de 50 ml que contienen individualmente DPBS, soluciones con células y biomoléculas, y adjuntar cada tubo a su respectivo soporte del vial conectado al sistema de control de flujo neumático (véase la Figura 3A). 18 </li><li> Conectar tubo de PEEK de entrada de los titulares de los viales en los respectivos orificios de entrada en el dispositivo de microfluidos. </li><li> Establecer la magnitud de pulsos de onda cuadrada, V, 100 V, a fin de tener la fie eléctricafuerza ld, E = V / L e, a través de la cámara de electroporación ser equivalente a 0,7 kV / cm. NOTA: Aquí, L e es la distancia entre dos puntos en los que los electrodos positivos y negativos están en contacto con la solución que fluye (véase la Figura 1). </li><li> Ajuste el regulador de presión de 40 psi. NOTA:. Una fuente de nitrógeno ajustable manualmente solo se utiliza para presurizar uniformemente todos los viales de muestra y un colector de alta velocidad se utiliza para activar oportuna puertos de soluciones individuales utilizando el software LabVIEW hecha a la medida 18 </li><li> Para el control de la válvula, abra el software LabVIEW hecha a la medida marcada Válvula Runner, y haga clic en Ejecutar en el menú desplegable titulado operar. </li><li> Abra las válvulas haciendo clic en cada icono de la válvula correspondiente. NOTA: El icono de la válvula cambiará a verde cuando se activa. Al hacer clic en el icono de activo se desactivará y cerrar la válvula. El icono de la válvula cerrada debe volverse gris. </li><li> Abra la válvula del depósito DPBS (es decir., solución de lavado) para cebar la velocidad de flujo requerida para estable generación de vórtice celular-trampeo durante 1,5 min. </li><li> Cambiar el puerto solución activa de la solución de lavado a la solución de células a las células en la cámara de trampa de electroporación durante 30 segundos (es decir, el paso de células que atrapan). </li><li> Flujo ambas soluciones de lavado y de células a través del dispositivo de manera simultánea durante 10 s antes de la etapa de células que atrapan para asegurar el flujo ininterrumpido durante el paso de la solución de conmutación. NOTA: Esta breve etapa de co-flujo se debe repetir en cada paso de la solución de conmutación. </li><li> Girar en el puerto de lavado y enjuague el dispositivo durante 20 segundos con el fin de eliminar las células contaminantes no atrapados. </li><li> Se inyecta la solución que contiene la primera molécula de interés (0,2 mg / ml de 3000 Da moléculas de dextrano neutro o aniónico y 1,5 mg / ml de 70000 Da molécula de dextrano neutro) en el dispositivo. </li><li> Aplicar cinco pulsos cortos (T = 30 mseg con intervalos de 2 seg) inmediatamente después de la inyección de lasolución molecular y monitorear la magnitud y duración de los pulsos eléctricos aplicados en tiempo real, utilizando un osciloscopio. </li><li> Repita el paso 3,10 tantas veces como el número de moléculas adicionales para ser entregado. Para cada entrega molecular, incubar las células para 100 s en la solución molecular y luego enjuagar el dispositivo con la solución de lavado de 100 s para eliminar el exceso de moléculas. </li><li> Liberar las células en una placa de 96 pocillos para el análisis de aguas abajo mediante la reducción de la presión de operación por debajo de 5 psi. NOTA: Aproximadamente 100 l de solución con 100 células se obtuvieron de cada versión. </li><li> Ejecute el experimental los pasos 3.9 a través de 3.16 tres veces para recolectar suficientes células para citometría de flujo. </li><li> Centrifugar la placa de 96 pocillos que contenía células procesadas durante 5 min a 228 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante que contiene moléculas fluorescentes exceso. </li><li> Resuspender las células en DPBS para análisis de citometría de flujo. </li><li> Células de carga en el citómetro de flujo para u molecularptake análisis de eficiencia. </li></ol>

<ol>
	<li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+Past+present+and+future.">Electroporation Past present and future.</a> Dev Growth Diff. 55, 15-19 (2013).</li><li>Geng, T., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electroporation+for+cellular+analysis+and+delivery.">Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery.</a> Lab Chip. 13, 3803-3821 (2013).</li><li>Shahini, M., van Wijngaarden, F., Yeow, J. T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+electro-microfluidic+channel+for+single+cell+electroporation.">Fabrication of electro-microfluidic channel for single cell electroporation.</a> Biomedical Microdevices. 15, 759-766 (2013).</li><li>Neumann, E., Toensing, K., Kakorin, S., Budde, P., Frey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+electroporative+dye+uptake+by+mouse+B+cells.">Mechanism of electroporative dye uptake by mouse B cells.</a> Biophysical Journal. 74, 98-108 (1998).</li><li>Jaroszeski, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+of+anticancer+agents+mediated+by+electroporation+in+vitro.">Toxicity of anticancer agents mediated by electroporation in vitro.</a> Anti-Cancer Drugs. 11, 201-208 (2000).</li><li>Buntru, M., Gartner, S., Staib, L., Kreuzaler, F., Schlaich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+multiple+transgenes+to+plant+cells+by+an+improved+version+of+MultiRound+Gateway+technology.">Delivery of multiple transgenes to plant cells by an improved version of MultiRound Gateway technology.</a> Transgenic Res. 22, 153-167 (2013).</li><li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses.">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4262-4267 (1999).</li><li>Heller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intradermal+delivery+of+interleukin-12+plasmid+DNA+by+in+vivo+electroporation.">Intradermal delivery of interleukin-12 plasmid DNA by in vivo electroporation.</a> DNA Cell Biol. 20, 381-381 (2001).</li><li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells.">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6, 747-754 (2011).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Effects+of+Nanosecond+Pulsed+Electric+Fields+Combined+with+Low+Concentration+of+Gemcitabine+on+Human+Oral+Squamous+Cell+Carcinoma.">Synergistic Effects of Nanosecond Pulsed Electric Fields Combined with Low Concentration of Gemcitabine on Human Oral Squamous Cell Carcinoma.</a> In Vitro PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kim, M. J., Kim, T., Cho, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+electroporation+chip+using+multiple+electric+field+zones+in+a+single+channel.">Cell electroporation chip using multiple electric field zones in a single channel.</a> Appl Phys Lett. 101, (2012).</li><li>Wang, S. N., Lee, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-/nanofluidics+based+cell+electroporation.">Micro-/nanofluidics based cell electroporation.</a> Biomicrofluidics. 7, (2013).</li><li>Sharei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vector-free+microfluidic+platform+for+intracellular+delivery.">A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery.</a> Proc. Natl Acad Sci USA. 110, 2082-2087 (2013).</li><li>Kim, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+human+neural+stem+cells+by+OCT4.">Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4.</a> Nature. 461, U649-U693 (2009).</li><li>Ozbas-Turan, S., Aral, C., Kabasakal, L., Keyer-Uysal, M., Akbuga, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-encapsulation+of+two+plasmids+in+chitosan+microspheres+as+a+non-viral+gene+delivery+vehicle.">Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle.</a> J Pharm Pharm Sci. 6, 27-32 (2003).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, U311-U313 (2007).</li><li>Hur, S. C., Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+size-based+rare+cell+enrichment+using+microscale+vortices.">High-throughput size-based rare cell enrichment using microscale vortices.</a> Biomicrofluidics. 5, (2011).</li><li>Yun, H. Y., Hur, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+multi-molecule+delivery+using+vortex-assisted+electroporation.">Sequential multi-molecule delivery using vortex-assisted electroporation.</a> Lab Chip. 13, 2764-2772 (2013).</li><li>Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory+and+methods,+perspectives+for+drug+delivery,+gene+therapy+and+research.">Electroporation theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research.</a> Acta Physiol Scand. 177, 437-447 (2003).</li><li>Wang, J., Zhan, Y. H., Ugaz, V. M., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vortex-assisted+DNA+delivery.">Vortex-assisted DNA delivery.</a> Lab Chip. 10, 2057-2061 (2010).</li><li>Jia, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonviral+minicircle+vector+for+deriving+human+iPS+cells.">A nonviral minicircle vector for deriving human iPS cells.</a> Nature Methods. 7, U146-U197 (2010).</li><li>Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+to+hematopoietic+stem+cells+Implications+for+gene+therapy+of+human+disease.">Gene transfer to hematopoietic stem cells Implications for gene therapy of human disease.</a> Annual Review of Medicine. 47, 11-20 (1996).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angew Chem-Int Edit. 37, 551-575 (1998).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Barsagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+Unlabeled+Proteins+into+Living+Cells+by+Electroporation+and+Isolation+of+Viable+Protein-Loaded+Cells+Using+Dextran+Fluorescein+Isothiocyanate+as+a+Marker+for+Protein-Uptake.">Introduction of Unlabeled Proteins into Living Cells by Electroporation and Isolation of Viable Protein-Loaded Cells Using Dextran Fluorescein Isothiocyanate as a Marker for Protein-Uptake.</a> Anal Biochem. 194, 198-203 (1991).</li><li>Dimitrov, D. S., Sowers, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Electroporation-Fast+Molecular-Exchange+by+Electroosmosis.">Membrane Electroporation-Fast Molecular-Exchange by Electroosmosis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1022, 381-392 (1990).</li><li>Sukharev, S. I., Klenchin, V. A., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev Yu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+electrophoretic+DNA+transfer+into+cells.+The+effect+of+DNA+interaction+with+electropores.">Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores.</a> Biophysical Journal. 63, 1320-1327 (1992).</li><li>Glogauer, M., McCulloch, C. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments.">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li><li>Verspohl, E. J., KaiserlingBuddemeier, I., Wienecke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+specific+antibodies+into+electropermeabilized+cells+is+a+valuable+tool+for+eliminating+specific+cell+functions.">Introducing specific antibodies into electropermeabilized cells is a valuable tool for eliminating specific cell functions.</a> Cell Biochemistry and Function. 15, 127-134 (1997).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con la nueva plataforma de electroporación paralelizado, mejora de 10 veces en el rendimiento y la eficiencia de la prestación de múltiples molécula se logró, además de todas las ventajas que el sistema de una sola cámara previamente desarrollado proporciona. 18 méritos Anteriormente disponibles incluyen (i) antes de la purificación de dirigirse a las células con una distribución uniforme del tamaño para la mejora de la viabilidad, (ii) control de la dosificación precisa y molecular individual, y...

En los últimos años, el uso de pulsos eléctricos para facilitar la entrega citosólica de moléculas extracelulares se ha convertido en un medio atractivo para la manipulación de células de mamífero. 1 Este proceso, también conocido como electroporación, permeabiliza reversiblemente la membrana celular, lo que permite la membrana inherentemente moléculas impermeables para acceder al medio intracelular de las células. Debido a que prácticamente cualquier molécula se puede introducir en el citosol a través de poros creados temporales en la membrana de cualquier tipo de células por medio de electroporación, la técnica ha sido reportado como siendo más reproducible, de aplicación universal, y más eficiente que otros métodos, incluyendo mediada por virus, química y los enfoques ópticos. 2-3 Esta técnica se ha utilizado para introducir moléculas fluorescentes, 4 drogas 5 y ácidos nucleicos 6-7 manteniendo células viables e intacto. Teniendo en cuenta estos beneficios, electroporación ha sido adoptado como un trabajo comúnAtory técnica de ADN para la transfección, in vivo la terapia génica 8 y estudios de vacunación celular. Es, sin embargo, sigue siendo difícil para los sistemas convencionales de electroporación para lograr simultáneamente eficiencia práctica y la viabilidad para las muestras con gran heterogeneidad en el tamaño debido a que la intensidad de campo eléctrico requerida para la electroporación éxito se correlaciona estrechamente con el diámetro de la célula. Por otra parte, esos sistemas no permiten un control preciso de los múltiples cantidades moleculares entregado debido a la confianza en el proceso de entrega molecular estocástico mayor. 9 A fin de abordar estas cuestiones, muchos grupos han desarrollado plataformas de electroporación de microfluidos, que ofrece la ventaja de voltajes inferiores poración, mejor eficiencia de transfección, una gran reducción de la mortalidad celular, y la capacidad de ofrecer múltiples moléculas. fueron posibles 10-13 Estas ventajas debido a las pequeñas dimensiones de los sistemas de electroporación microescala cuyo electrodo de tonolongitudes son sub-milímetros, disminuyendo drásticamente tensiones requeridas para la entrega exitosa. Además, estos sistemas de electroporación microescala pueden lograr una distribución de campo eléctrico uniforme y rápidamente disipar el calor generado, produciendo mortalidad celular reducida al tiempo que mejora la eficiencia de la entrega. La utilización de materiales transparentes para estos microchips adicionales permite la observación in situ del proceso de electroporación para las modificaciones de parámetros rápidas. 2,12 Sin embargo, el control de la dosificación precisa y el control de parámetros-molecular y celular dependiente, requerido para la investigación y aplicaciones terapéuticas, 6 emergente, 14-16 todavía siguen sin resolverse. Este trabajo presenta un sistema de electroporación de microfluidos vórtice asistida, capaz de entregar múltiples moléculas secuencialmente en una población idéntica pre-seleccionado de las células diana. Las células con distribución de tamaño uniforme son aislados antes de la electroporación utilizando si se informó anteriormentemecanismo-ze selectiva de captura. 17-18 Al tener una distribución uniforme del tamaño, menor variación en la eficiencia de la electroporación y la mayor viabilidad por determinada intensidad de campo eléctrico se lograron. 19 Por otra parte, se agitaba continuamente células atrapadas utilizando vórtices microescala permitido para la entrega uniforme de moléculas a través de la citosol entero, de acuerdo con los resultados previamente reportados usando otra plataforma electroporación vórtice asistida. 20 Para demostrar que este sistema sería aplicable a una amplia gama de moléculas comúnmente utilizados en aplicaciones biológicas, macromoléculas con una amplia gama de pesos moleculares fueron entregados a metastásico de células de cáncer de mama. Además, con la ayuda de la monitorización de procesos en tiempo real, este trabajo proporciona más evidencias de poner fin al largo debate permanente sobre el mecanismo de entrega molecular durante electrporation, siendo predominantemente mediada por electroforesis versus difusión mediada. 14 </sup&gt; A diferencia de otros sistemas de electroporación, esta plataforma proporciona de forma única las ventajas combinadas de entrega precisa multi-molécula, de alta eficiencia en la entrega molecular, la mortalidad celular mínima, un amplio abanico de tamaño y cargos de moléculas entregados, así como la visualización en tiempo real de la electroporación proceso. Dadas estas capacidades, el sistema de electroporación desarrollado tiene potencial práctico como una herramienta versátil para los estudios de reprogramación celular, aplicaciones de suministro de drogas 6,14,21-22 10,19 y aplicaciones que requieren de la comprensión en profundidad de los mecanismos de entrega de electroporación moleculares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:475px;">MDA-MB-231 cancer cell line</td>
			<td style="width:297px;">American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td style="width:119px;">HTB-26</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Leibovitz&#8217;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">10-045-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:475px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Trypsin</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Flow Cytometer easyCyte HT</td>
			<td style="width:297px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">0500-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Oxygen Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:297px;">Technics Micro-RIE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dektak 6M surface profiler</td>
			<td style="width:297px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">KMPR 1050</td>
			<td style="width:297px;">Microchem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Nitrogen gas</td>
			<td style="width:297px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">High Pressure Regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td>6162K22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Downstream regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">4000K563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">high-speed 3/2way-8 valve manifold</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Inline Check Valve</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">CV3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">5/32&#34; OD x 3/32&#34;ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td>PU-156F-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/4&#34; OD X 0.17&#34; ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td style="width:119px;">PU-250PB-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/16&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;">P1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/32&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">PEEK tubing unions</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Pulse Generator</td>
			<td style="width:297px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">8110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Aluiminum Wire</td>
			<td style="width:297px;">Bob Martin Company</td>
			<td style="width:119px;">6061 ALUM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">oscilloscope</td>
			<td style="width:297px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSO3062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">T75 culture flask</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3329</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

La electroporación ha recibido una creciente atención en los últimos años, debido a que es una técnica muy poderosa para la introducción de sondas moleculares físicamente exógenos no permeantes en las células. Este trabajo presenta una plataforma de electroporación de microfluidos capaz de realizar la entrega molécula múltiple para células de mamífero con control de parámetros precisos y molecular-dependiente. La capacidad del sistema para aislar células con una distribución de tamaño uniforme permite una menor variación en la eficiencia de la electroporación por intensidad de campo eléctrico dado; por lo tanto, una mayor viabilidad de la muestra. Además, su función de visualización de procesos permite la observación del proceso de absorción molecular fluorescente en tiempo real, lo que permite ajustes de parámetros de entrega moleculares rápidas in situ para la mejora de la eficiencia. Para mostrar las enormes capacidades de la plataforma informado, macromoléculas con diferentes tamaños y cargas eléctricas (por ejemplo, dextrano con un PM de 3.000 y 70.000 Da) fueronentregado a las células de cáncer de mama metastásico con altas eficiencias de entrega (&gt; 70%) para todas las moléculas ensayadas. La plataforma desarrollada ha demostrado su potencial de uso en la expansión de los campos de estudio en el chip técnicas de electroporación pueden ser beneficiosos.

El electroporador microfluidos paralelo desarrollado entregado macromoléculas con varios tamaños y cargas eléctricas en las células de cáncer de mama metastásico que viven. El éxito de la entrega molecular se determinó cualitativamente mediante la supervisión de los cambios en la intensidad de fluorescencia de las células que orbitan alrededor de electroporación in situ y confirmado por mediciones cuantitativas mediante análisis de citometría de flujo. Figura 4A muestra que el 90% ...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada.

Vortex asistida Microscale Electroporador para entrega secuencial Molecular

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K vistas.  Harvard University.  Una plataforma de electroporación asistida vórtice de microfluidos fue desarrollado para la entrega secuencial de múltiples moléculas en poblaciones de células idénticas con control de la dosificación precisa e independiente. Tamaño basado electroporación anterior etapa de purificación de células diana del sistema ayudado a mejorar la eficiencia de la entrega molecular y la viabilidad celular procesada. 

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

De bajo peso molecular de proteínas en el enriquecimiento de las películas delgadas de silicio mesoporosos para el descubrimiento de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Investigación

Bioingeniería

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Piel tatuaje como un nuevo enfoque para la entrega de vacunas de ADN

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular<em&gt; In Vitro</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

Biofuncionalizadas prusiana nanopartículas azul para Multimodal Molecular Aplicaciones de imágenes

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

Analizando Mezcla falta de homogeneidad en un dispositivo de microfluidos por Microscale Schlieren Técnica

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

Mesenquimales estromales de cultivo celular y de entrega en autólogas Condiciones: Enfoque inteligente para aplicaciones ortopédicas

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Análisis de TC de cuatro dimensiones mediante el registro secuencial 3D-3D

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...